Data quality control and mass recalibration standardize MALDI Imaging and enhance interpretability across large datasets

Standardizace MALDI Imaging pomocí kontroly kvality dat a přepočtu hmotnosti

Význam tématu

Kontrola kvality dat a přesné vyhodnocení m/z jsou zásadní pro důvěryhodné molekulární závěry v MALDI Imaging. I malé posuny v m/z vedou k nesouladu píků, chybné annotaci a snížené srovnatelnosti mezi pixely, řezy a experimenty. Systematické nástroje pro monitorování, diagnostiku a opravu posunů zvyšují reprodukovatelnost a umožňují robustní prostorovou biologii a validaci výsledků napříč laboratořemi.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo představit a ověřit nové nástroje v softwaru SCiLS Lab (verze 2027a, preview): QC View, Mass Variation Statistics a Mass Recalibration/Alignment workflow. Studie demonstrovala, jak tyto nástroje hodnotí kvalitu dat a opravují hmotnostní odchylky na reálných lidských tkáních připravených pro on-tissue bottom-up proteomiku, čímž se zvýšila interpretovatelnost a porovnatelnost rozsáhlých datasetů.

Použitá metodika

Práce použila lidské vzorky připravené podle publikovaných protokolů pro on-tissue bottom-up MALDI Imaging. Data byla získána instrumentem timsTOF fleX v oTOF režimu v rozsahu m/z 500–2 500 a s rozlišením pixlu 50×50 µm2 a 60×60 µm2. Surová data byla importována do náhledu SCiLS Lab 2027a. Pro analýzu kvality byla využita nová QC View pro vizualizaci iontové intenzity, celkového iontového počtu, obrazu driftu m/z a dalších metrik; Mass Variation Statistics kvantifikoval variabilitu m/z; a Mass Recalibration/Alignment workflow prováděl spektrální přepočet nebo zarovnání založené na interních standardech nebo vybraných funkcích.

Použitá instrumentace

• timsTOF fleX (Bruker) v oTOF režimu.
• SCiLS Lab 2027a (preview) – moduly: QC View, Mass Variation Statistics, Mass Recalibration/Alignment.
• Interní referenční standardy: vícenásobné peptidové standardy aplikované na tkáň (včetně [Glu]-Fibrinopeptide B a víceropeptidového standardu GPAGPKR atd.).

Hlavní výsledky a diskuse

• Vizualizační panel QC View nabízí čtyři hlavní pohledy: zobrazení iontové intenzity a celkového iontového počtu, obraz driftu m/z, Mass Recalibration/Alignment workflow a Mass Variation Statistics, což umožňuje komplexní posouzení kvality jednotlivých iontů i celého datasetu.
• Přidání vícepípkového interního referenčního standardu na vzorek lidského hepatocelulárního karcinomu mírně zlepšilo průměrnou kalibrační chybu po přepočtu provedeném v SCiLS Lab, čímž byla zvýšena celková přesnost dat.
• V případě rozsáhlého datasetu z pacientských vzorků prostatického karcinomu byla zjištěna výrazná vnitro- a mezidatasetová hmotnostní odchylka způsobená poruchou vodního chlazení letu trubice. Porucha vedla k teplotně závislé variaci driftové dráhy a v důsledku toho ke ztrátě přesnosti m/z.
• Při této poruše byl interní standard [Glu]-Fibrinopeptide B k přepočtu nepoužitelný kvůli velmi nízkému izolovanému podílu píků (isolated peak rate 1,4 %). Isolated peak rate je metrika udávající procento pixelů, kde je v daném m/z intervalu přítomen pouze jeden signál nad šumem.
• Místo toho byla zvolena lokální funkce na m/z 1302.6545 s vysokým izolovaným podílem 92,7 % v daném širokém intervalu (165 ppm) pro spektrální zarovnání. Toto zarovnání plně odstranilo artefakt hmotnostní přesnosti a po úpravě interní standard dosáhl přesnosti 1,8 ppm.
• Mass Variation Statistics kvantifikoval rozptyl m/z a umožnil detekovat oblasti s nízkou přesností (viz histogramy a obrazy mass precision). Tyto informace byly klíčové pro rozhodnutí mezi přepočtem pomocí externích standardů a lokálním zarovnáním na robustní funkce.

Přínosy a praktické využití metody

• Transparentní a kvantifikovatelná kontrola kvality zvyšuje důvěru v prostorové anotace molekul a podporuje reprodukovatelnost mezi experimenty a laboratořemi.
• Metody nabízené v SCiLS Lab umožňují rychlou diagnostiku zdrojů chyby (např. termální drift způsobený chladicím systémem) a volbu vhodné opravné strategie (interní kalibrace vs. lokální zarovnání).
• Metoda isolated peak rate poskytuje praktický ukazatel použitelnosti konkrétního referenčního píku pro přepočet v rámci obrazové oblasti.
• Workflow výrazně usnadňuje zpracování velkých datasetů, kde manuální kontroly nejsou praktické, a podporuje standardizaci postupů v projektech více center.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace QC: integrace automatických rutin pro sledování mass driftu a návrhy korektivních akcí v reálném čase.
• Standardizace interních referencí mezi laboratořemi tak, aby bylo možné dosahovat kompatibility dat v multi‑centrických studiích.
• Pokročilé algoritmy pro výběr optimálních referenčních funkcí (např. pomocí strojového učení) a adaptivní lokální přepočet tam, kde interní standardy chybí nebo jsou nevhodné.
• Rozšíření nástrojů QC na širší rozsahy m/z a multimodální workflow (např. korelace s LC‑MS/MS nebo ion mobility daty) pro zvýšení jistoty v anotacích.
• Využití metrik jako isolated peak rate pro plánování experimentů a přípravu vzorků (optimalizace aplikace standardů, rozlišení pixelů apod.).

Závěr

Nová sada nástrojů ve SCiLS Lab (QC View, Mass Variation Statistics a Mass Recalibration/Alignment) poskytuje systematický přístup ke kontrole kvality a opravě hmotnostních odchylek v MALDI Imaging. V praxi to vede k lepší přesnosti m/z, vyšší reprodukovatelnosti a větší jistotě v molekulárních interpretacích. Příklady zahrnují jak mírné zlepšení kalibrace pomocí vícepípkových interních standardů, tak úspěšné odstranění rozsáhlých driftů pomocí lokálního spektrálního zarovnání, když standardy nejsou použitelné.

Reference

Heijs B., Pascale‑Henke A., Zoellner K., Taylor H., Ippolito J., Clark C., Boskamp T., Drake R.R., Angel P. (Bruker a akademická pracoviště). Data a příklady uvedené ve firemním materiálu Bruker 2026; použit SCiLS Lab 2027a (preview) a timsTOF fleX. Konflikt zájmů: Někteří autoři jsou zaměstnanci Bruker Corporation.