Proteomic Profiling Reveals Differential Protein Patterns in Galdieriasulphurariaextracts replacing fetal bovine serum in muscle cell culture

Proteomické profilování Galdieria sulphuraria jako náhrada séra při kultivaci svalových buněk

Význam tématu

Rostoucí tlak na udržitelnost, etiku a snížení závislosti na živočišné produkci zrychluje vývoj kultivovaného masa. Klíčovou překážkou komerčního rozšíření je závislost na fetálním bovinním seru (FBS), které zvyšuje náklady, etické problémy a variabilitu kultivačních systémů. Identifikace levných, bezpečných a funkčních náhrad FBS je proto zásadní pro průmyslové výroby buněčných potravin.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit proteinové extrakty z červené mikrořasy Galdieria sulphuraria jako možné náhrady FBS v kultivaci myoblastů (linie C2C12) a porovnat účinky hrubých extraktů (CE) a teplem ošetřených extraktů (HE) na viabilitu, proliferaci a diferenciaci buněk. Součástí bylo i proteomické porovnání CE versus HE k identifikaci proteinových vzorců spojených s cytotoxicitou nebo podporou růstu.

Použitá metodika a instrumentace

Krátký přehled experimentálního postupu:

• Generování vzorků: extrakce proteinů z Galdieria sulphuraria, příprava hrubých (CE) a heat-inaktivovaných (HE) frakcí.
• Sample preparation: tryptická digestace vzorků pomocí iST sample preparation kitu (PreOmics) a čištění peptidů.
• Peptidová koncentrace: resuspense a úprava koncentrace peptidů na 500 ng/µl; do LC-MS bylo injektováno 500 ng peptidů na vzorek.
• LC-MS akvizice: nano-LC systém nanoElute 2 (Bruker Daltonics) s 22min gradientem; akvizice dat v dia-PASEF režimu na timsTOF HT (Bruker Daltonics).
• Datová analýza: ko‑zpracování výsledných souborů v přímém DIA vyhledávání (directDIA) a label-free kvantifikace pomocí Spectronaut (Biognosys).

Použitá instrumentace

• PreOmics iST sample preparation kit (Planegg, Germany)
• nanoElute 2 nano-LC (Bruker Daltonics)
• timsTOF HT s dia-PASEF akvizicí (Bruker Daltonics)
• Spectronaut software pro directDIA a LFQ (Biognosys)

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky in vitro kultivací:

• Hrubé extrakty (CE) vykazovaly výraznou cytotoxicitu: snížená viabilita, oslabená metabolická aktivita, změněná morfologie buněk a potlačená proliferace.
• Teplem ošetřené extrakty (HE) naopak podporovaly viabilitu a metabolickou aktivitu v podmínkách sníženého séra a umožnily postupnou náhradu až 80 % FBS během dlouhodobé kultivace. Buňky zachovaly schopnost terminální myogenní diferenciace.

Proteomické poznatky:

• Komparativní label-free analýza ukázala jasné oddělení CE a HE vzorků v PCA, přičemž první komponenta vysvětlovala většinu variance, což potvrzuje konzistentní kvalitativní a kvantitativní rozdíly v proteinových profilech.
• Hierarchické shlukování a heatmapy dokumentovaly ztrátu určitých skupin proteinů po tepelné úpravě (pravděpodobně precipitace nebo denaturace cytotoxických proteinů) a současné obohacení nebo zvýraznění jiných proteinů v HE (možné heat‑stabilní růst‑podporující faktory).
• Tato diferenciace naznačuje, že heat‑treatment selektivně eliminuje škodlivé proteiny a/nebo uvolňuje či stabilizuje proteiny s příznivým biologickým efektem.

Diskuse a omezení:

• Proteomický přístup umožňuje rychlé mapování rozdílů, avšak identifikace konkrétních proteinů jako příčin cytotoxicity nebo podpory růstu vyžaduje následné cílené studie (funkční add-back, frakcionace, cílená kvantifikace).
• Label‑free directDIA poskytuje robustní přehled, ale absolutní kvantifikace a potvrzení postranslačních modifikací (glykozylace, proteolýza) potřebují speciální přístupy.

Přínosy a praktické využití metody

• Demonstrace, že heat‑inaktivované proteinové extrakty z Galdieria mohou nahradit většinu FBS v kultivaci C2C12, představuje praktický krok směrem k etičtějším a cenově dostupnějším médiím pro produkci kultivovaného masa.
• Workflow kombinující zjednodušenou preparaci (iST kit), rychlou LC‑MS akvizici (timsTOF HT/dia‑PASEF) a directDIA analýzu je efektivní platformou pro screening a optimalizaci extrakčních postupů.
• Proteomická data slouží jako vodítko pro cílenou izolaci škodlivých faktorů a identifikaci heat‑stabilních aktivních složek, které lze následně purifikovat nebo rekombinantně vyrábět pro definovaná média.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Cílená kvantifikace a validace: nasazení PRM/SRM nebo paralelní reakční monitorace pro potvrzení kandidátních proteinů a stanovení jejich dávkově‑odpovědnostních vztahů.
• Frakcionace a bio‑assay‑guided purification: kombinace chromatografických frakcí s buněčnými assay pro izolaci aktivních či toxických podfrakcí.
• Analýza posttranslačních modifikací: glykopeptidomika a mapování proteolytických štěpení, které mohou určovat biologickou aktivitu.
• Optimalizace extrakčních a stabilizačních protokolů pro průmyslový scale‑up a standardizaci produktu z hlediska bezpečnosti potravin.
• Integrace multi‑omics (proteomika + metabolomika) pro komplexnější pochopení mechanismů podpory růstu buněk.

Závěr

Studie ukazuje, že heat‑inaktivované proteinové extrakty z Galdieria sulphuraria představují perspektivní náhradu části FBS v kultivačních médiích pro myoblasty, přičemž proteomická analýza poskytuje klíčové informace pro identifikaci škodlivých a růst‑podporujících složek. Další cílené experimenty jsou nezbytné pro ověření konkrétních proteinových kandidatů, optimalizaci extrakce a zajištění bezpečnosti a reprodukovatelnosti pro aplikace v průmyslové produkci kultivovaného masa.

Reference

1. Hütker S., Wellkamp H., Tellström V., Lang I., Berger F., Ghose S. Proteomic Profiling Reveals Differential Protein Patterns in Galdieria sulphuraria extracts replacing fetal bovine serum in muscle cell culture. 4D‑Multiomics; ASMS 2026, THP489. 2026.
2. Konflikt zájmů: Shourjo Ghose a Verena Tellström jsou zaměstnanci společnosti Bruker a mohou mít finanční zájmy ve společnosti.