Rapid Quantification of Clinically Relevant Compound Classes by Chromatography-Free DART-MS/MS

Význam tématu

Monitoring koncentrací léčiv v biologických matricích je klíčový pro bezpečnost a účinnost farmakoterapie. Tradiční LC-MS/MS metody poskytují vysokou selektivitu a citlivost, ale při nižším počtu stanovišť představují časovou i finanční zátěž kvůli dlouhým doběhům chromatografie, spotřebě mobilních fází a častým servisním zásahům. Chromatografie-free přístupy jako DART-MS/MS slibují výrazné zrychlení analýzy, snížení spotřeby rozpouštědel a minimalizaci provozní režie, což je pro klinickou farmacii a vysokopropustné výzkumné laboratoře atraktivní.

Cíle a přehled studie

Studie představuje validaci DART-MS/MS metody pro rychlou kvantifikaci klinicky relevantních tříd sloučenin v séru/plazmě bez chromatografie. Cílem bylo ukázat lineární rozsahy, přesnost, denzitu mezi LC-MS/MS a DART-MS/MS, stabilitu vzorků a provozní výkonnost při vysokém průtoku (HTS).

Použitá metodika

Metoda využívá jednoduchou extrakci kapalina–kapalina (LLE) s následujícím postupem:

• 50 µL séra, přidání 20 µL interního standardu a 100 µL extrakčního roztoku (u některých analyz je přidána sůl pro zlepšení fázového oddělení).
• Vortex, centrifugace, odběr 5 µL vrchní (organické) fáze.
• Naneseno na HTS96 DART síťku a sušení <5 min, následná analýza DART-MS/MS (~<30 s na vzorek).

Validace zahrnovala:

• Lineární kalibrace: 12 koncentračních hladin, 5 replikací v séru; R² typicky >0,99.
• Precision/intrarun a interdenní: QCs na 3 úrovních, 10 dnů, 4 časové body/den; přesnost v požadovaných limitech, trueness 85–115 %.
• LOQ/LOD: úrovně citlivosti odpovídají klinickým požadavkům.
• Stabilita: extrahované vzorky na síťce stabilní při pokojové teplotě minimálně 7 hodin.
• Carry-over: žádné pozorované; interní standard <20 % při LLOQ.
• Matrix efekt a extrakční efektivita: splněné akceptační kritéria.

Použitá instrumentace

• Hmotnostní spektrometr EVOQ® DART-TQ+ (Bruker) s DART zdrojem.
• Optimalizace MS/MS tranzic, kolizní energie, teploty zdroje, velikosti spotu, průtoku kuželového plynu a napětí na mřížce pro jednotlivé panely.
• HTS96 DART plate (síťka) pro rychlé nanášení vzorků.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala vysokou lineárnost v širokých analytických rozmezích (příklady: topiramát 1.046–222 mg/L, další analyty v rozsahu 0.012–214 mg/L), s R² typicky nad 0,99. Mezi nejčastěji sledované látky patřily antiepileptika (topiramát, zonisamid, rufinamid, perampanel, brivaracetam, lacosamid), mykopyfenolát (MPA) a antimykotika (fluconazol, itraconazol a metabolity, isavuconazol, posakonazol, vorikonazol).

Porovnání s LC-MS/MS bylo prováděno na 223 reálných klinických vzorcích a 105 navázaných (spiked) sérech. Korelace ukázala vysokou shodu: R² v porovnání často >0,99 a sklony (slopes) mezi cca 0,87–1,22 v závislosti na analytu. Průměrný bias v porovnání s LC-MS/MS se pohyboval mezi ~3,1 % až 13,4 % dle analyzu, tedy v rámci akceptovatelných limitů pro výzkumné účely. LOD/LOQ byly dostatečně nízké pro klinicky relevantní koncentrace.

Z praktického hlediska nebyly zjištěny interferující signály v testech zahrnujících 144 dalších látek (neuroleptika, antidepresiva, benzodiazepiny), což svědčí o dobré selektivitě přístupu v kombinaci s MS/MS tranzicemi. Nicméně absence chromatografie zvyšuje závislost na selektivitě hmotnostního spektrometru a kvalitě přípravy vzorku; je proto nutné důkladné optimalizace tranzic a interních standardů pro každou skupinu látek.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazně vyšší průtok: analýza <30 s na vzorek, což umožňuje např. 96 vzorků pod 48 minut.
• Snížení spotřeby rozpouštědel a spotřebního materiálu až o 95 % oproti LC-MS/MS, nižší provozní náklady a výhodnější environmentální profil.
• Minimalizovaná údržba (žádné HPLC kolony, menší riziko kontaminace iontového zdroje spojené s HPLC aditivy).
• Vhodné pro výzkumné oddělení a vysokopropustné screeningy terapeutického monitoringu, farmakokinetiky a studie expozice.

Omezení a rizika

• Metoda je v prezentovaném provedení určena pro výzkumné účely (For Research Use Only), nikoliv pro rutinní diagnostiku bez další validace podle regulačních požadavků.
• Bez chromatografie může docházet k potenciálnímu supresi iontů nebo neidentifikovaným interferencím v komplexních matricích; vyžaduje se robustní interní standardizace a kontrola matice.
• Některé analyty mohou vyžadovat specifické optimalizace přípravy vzorku nebo tranzic pro dosažení požadované citlivosti a přesnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje této přístupu zahrnují rozšíření aplikačního spektra na tricyklická antidepresiva, neuroleptika, benzodiazepiny, vitaminy a antibiotika. Dále lze očekávat:

• Integraci DART-MS/MS do HTS workflow pro farmakokinetické studie a terapeutický monitoring v research labouratořích.
• Vylepšení softwarových nástrojů pro automatizovanou kvantifikaci a korekci matice.
• Možné přechody k validacím podle klinických a regulačních standardů pro omezené rutinní nasazení po pokrytí požadovaných bezpečnostních a kvalitativních parametrů.

Závěr

Prezentovaná studie dokládá, že DART-MS/MS na platformě EVOQ® DART-TQ+ představuje životaschopnou chromatografii-free alternativu pro rychlou kvantifikaci několika skupin klinicky relevantních léčiv v séru a plazmě. Metoda nabízí významné časové a nákladové úspory při zachování vysoké linearity, přijaté přesnosti a dobré shody s LC-MS/MS. Pro rutinní diagnostické použití je však nutné provést další validační kroky přizpůsobené regulačním požadavkům.

Reference

1. Zonderman J., Putnam S., Filipenko A., Ingendoh A., Aventura Z., Brunner L., Wolfram G., Elicone C. Rapid Quantification of Clinically Relevant Compound Classes by Chromatography-Free DART-MS/MS. Bruker Daltonics GmbH & Co. KG; A SMS 2026. For Research Use Only.