Easy-to-Use, Plug-and-Spray Ion Source for Robust and Reproducible Ultra High Pressure Nanoflow LC/MS

Význam tématu

Nanoflow LC/MS je klíčová metoda pro proteomiku díky své extrémní citlivosti, která umožňuje detekci nízkých množství peptidů a proteinů. V praxi je však provoz nanoflow režimů často nespolehlivý: nevhodné spojky, mrtvé objemy a nestabilní vysoké napětí vedou k rozšiřování píků, ztrátě citlivosti a špatné reprodukovatelnosti. Integrované, snadno použitelné řešení, které minimalizuje tyto chyby, má přímý dopad na kvalitu dat, opakovatelnost experimentů a nasazení nanoflow technik i v méně specializovaných laboratořích.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem technické poznámky bylo demonstrovat, že zdokonalený „plug-and-spray" iontový zdroj EASY-Spray spolu s předmontovanými EASY-Spray kolonkami zjednodušuje provoz ultra vysokotlaké nanoflow LC/MS a současně zachovává nebo zlepšuje chromatografické vlastnosti. Studie se zaměřila na klíčové metriky: chromatografickou rozlišitelnost a kapacitu, reprodukovatelnost retenčních časů, náchylnost ke ztrátě výkonu při opakovaných vstupech a mezi-kolonkovou konzistenci.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala separace a analýzy standardních i komplexních vzorků při různých průtocích a teplotách kolony. Vzorky: BSA tryptický digest (100 fmol), E. coli digesty (500 ng) a lidské buněčné digesty (k569, 1000 ng). Mobilní fáze byla typická pro proteomiku: A = voda + 0,1 % kyseliny mravenčí, B = acetonitril + 0,1 % FA. Gradienty a doby běhu se lišily podle délky kolony (např. 5→30 % B v 15 min pro BSA; 5→30 % B v 60 min pro E. coli; 5→30 % B v 240 min pro lidský digest). Testovány byly různé průtoky (150, 300, 400, 500 nL/min) a teploty kolony (ambient, 35 °C, 45 °C, 55 °C). Data zpracovány v Proteome Discoverer 1.3 s vyhledáváním v Mascot a filtrováním na 1 % FDR.

Použitá instrumentace

• Nano-LC systém: Thermo Scientific EASY-nLC 1000.
• Integrovaný iontový zdroj a kolony: Thermo Scientific EASY-Spray zásuvné kolony (dostupné délky 15 cm, 25 cm, 50 cm; vnitřní průměry 50 µm a 75 µm) s nanoViper ZDV (zero-dead-volume) fingertight spojkami.
• Kolonová výplň: Acclaim PepMap RSLC C18, 2 µm částice.
• Mass spectrometry: Thermo Scientific Orbitrap Elite a Orbitrap Velos Pro; MS parametry: Orbitrap full scan (30 000–60 000), následované CID MS/MS; rozprašovací napětí ~1800 V, teplota kapiláry 250 °C.
• Software: Proteome Discoverer 1.3 s Mascot (1 % FDR) pro identifikace proteinů/peptidů.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografická účinnost: Systém poskytl velmi ostré píků; u 100 fmol BSA byly naměřené šířky píků ~3,5 s (FWHM) na 15 cm/50 µm koloně při 300 nL/min a 35 °C, což svědčí o nízkém mrtvém objemu a vysoké efektivnosti separace.
• Proteomické pokrytí: Z 500 ng E. coli digestu bylo při 60min gradientu a 300 nL/min identifikováno více než 1000 unikátních proteinů na Orbitrap Elite. Při použití delší 50 cm kolony (75 µm i.d.) a 240min gradientu z 1000 ng lidského digestu přes 4000 unikátních proteinů z jediné analýzy.
• Stabilita při různých průtocích: Vysoká rozlišitelnost a proteomické pokrytí se udržely při průtocích od 150 do 500 nL/min, což ukazuje flexibilitu pro různé pracovní režimy.
• Retenční časová reprodukovatelnost: Vysoká přesnost retenčních časů byla prokázána opakovanými běhy (20 a více injekcí) – CV retenčních časů pod 0,4 % při pokojové teplotě a ~0,3 % při zahřáté koloně (35–55 °C). Takové hodnoty jsou vhodné pro label-free kvantifikaci a cílené aplikace.
• Mezi-kolonková konzistence a životnost: Test tří nezávislých EASY-Spray kolon ukázal velmi podobné chromatogramy a retenční časy. Dále bylo prokázáno, že kolona zachovává výkon po 200 injekcích 500 ng E. coli digestu bez významné degradace rozlišení či posunu retenčních časů.

Přínosy a praktické využití metody

• Plug-and-spray přístup minimalizuje uživatelské chyby při montáži, eliminuje PEEK-slípky a mrtvé objemy pomocí nanoViper ZDV spojek — přímý přínos je vyšší citlivost a ostřejší píky.
• Integrované řešení (kolona + topné těleso + elektroda + emitter) šetří čas při nasazení a snižuje riziko poškození emitteru díky automatickému zasunutí při odpojení.
• Dostupné délky kolony (až 50 cm) zachovávají vysokou rozlišitelnost a kapacitu náběru vzorku, čímž překonávají omezení krátkých microfluidic/čipových systémů, které mají nižší rozlišení a kapacitu.
• Vhodné pro široké spektrum aplikací: discovery proteomika, label-free kvantifikace, PRM/MRM cílené experimenty a analýzy vzorků s nízkým množstvím materiálu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další integrace s automatizovanými pracovními postupy pro vyšší propustnost a rutinní analýzy v klinických či průmyslových laboratořích.
• Rozšíření kompatibility na další typy stacionárních fází a modificované chemie povrchu kolony pro lepší separaci posttranslačních modifikací a hydrofobně-charged peptidů.
• Optimalizace emitterských tvarů a materiálů pro ještě stabilnější nanospray při velmi nízkých průtocích a při analýzách vyžadujících extrémní citlivost (single-cell proteomics).
• Možné kombinace se softwarovými nástroji pro přesnější porovnávání mezi běhy (alignment) a pro zefektivnění label-free kvantifikace díky velmi nízkým CV retenčních časů.
• Zachování kompromisu mezi miniaturizací (chip-based) a výkonem: očekávaný trend je směřování k řešením, která nabídnou robustnost EASY-Spray a současně snížené spotřeby reagencií.

Závěr

EASY-Spray koncept nabízí praktické a robustní řešení pro nasazení nanoflow LC/MS: eliminuje chyby spojů a mrtvé objemy, přináší opakovatelnou vysokou chromatografickou účinnost a vynikající retenční časovou stabilitu. Výsledky ukazují, že systém zvládá jak citlivé analýzy nízkých množství (BSA, 100 fmol), tak rozsáhlé proteomické studie s vysokým počtem identifikovaných proteinů a dlouhou životností kolony. Díky jednoduchosti použití a konzistentnímu výkonu je tento přístup atraktivní pro rutinní i výzkumné aplikace v proteomice.

Reference

• Kiyonami R., Ravnsborg C., Madsen O., Zabrouskov V. EASY-to-Use, Plug-and-Spray Ion Source for Robust and Reproducible Ultra High Pressure Nanoflow LC/MS. Thermo Fisher Scientific Technical Note TN63546, 2016.