Identification of Isomeric Amino Acids In The Antigen Binding Region Of A Monoclonal Antibody By Electron Capture Dissociation

Význam tématu

Peptidové mapování pomocí LC/MS je klíčovým nástrojem při charakterizaci primární struktury monoklonálních protilátek (mAb) v biofarmaceutickém vývoji. Rozlišení izomerických aminokyselin (např. leucin/isoleucin, aspartát/isoaspartát) má zásadní význam, protože izomerizace může ovlivnit vazebnou afinitu a stabilitu terapeutických mAb, představovat kritické riziko kvality a ovlivnit doby použitelnosti přípravku.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce bylo ukázat využitelnost elektronového zachycovacího rozkladu (Electron Capture Dissociation, ECD) pro neambiguitní identifikaci izomerických zbytků v komplementarity-determining region (CDR) mAb. Studie porovnává konvenční CID (collision induced dissociation) a ECD u tryptických peptidů z CDR a demonstruje, jak ECD generuje charakteristické vedlejší (w-) ionty a z-/c-ionty, které umožňují rozlišení izomerů.

Použitá metodika

• Příprava vzorku: mAb denaturována v 3 M guanidin-HCl v 100 mM Tris-HCl (pH 7,5), redukována 5 mM DTT po 30 min při 60 °C, alkylována 10 mM iodoacetamidem 1 h při 37 °C, následná tryptická digesce 4 h při 37 °C.
• Chromatografie: RP-LC na AdvanceBio Peptide Mapping C18 (2.1 x 150 mm, 2.7 µm) na Agilent 1290 Infinity II Bio LC; mobilní fáze voda / acetonitril s 0,1 % kyseliny mravenčí.
• Hmotová spektrometrie: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s dvojitým Jet Stream ESI zdrojem a ExD buňkou pro ECD. Data zpracována v Agilent MassHunter Qualitative Analysis a ExDViewer.
• Analytický přístup: porovnání TIC a EIC pro cílové tryptické peptidy, následná MS/MS fragmentace pomocí CID a ECD, sledování typických fragmentů (b/y pro CID; c/z a vedlejší w pro ECD) a neutrálních ztrát charakteristických pro izomery.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografie a detekce: pro peptid z CDR byly v EIC detekovány dva chromatografické píky se stejnou m/z při retenčních časech ~21.1 a 21.3 min, indikující izomerické formy téhož peptidu.
• Rozlišení Leu/Ile: ECD spektra odhalila přítomnost dvou leucinových zbytků. Identifikace vychází z charakteristických w-iontů vznikajících vedlejším štěpením postranního řetězce — leucin generuje z-43 (z- ion o 43 amu) odpovídající ztrátě isopropylového radikálu, zatímco isoleucin by měl vykazovat z-29 (ztráta ethylového radikálu). Tyto rozdíly nebyly spolehlivě pozorovatelné v CID spektrech.
• Rozlišení Asp/isoAsp: ECD umožnila rozpoznat isoaspartát podle posunu o 57 amu relativně k odpovídajícím z-iontům pro aspartát (z-57), zatímco v „nativní" formě peptidu byla pozorována neutrální ztráta 44 amu indikující aspartát. Tento rozdíl má zásadní význam, protože izomerizace na isoAsp mění chemickou topologii peptidu a může ovlivnit funkci vazebného místa.
• Komparace CID vs ECD: CID produkovala převážně b- a y-ionty a neposkytla dostatečnou informaci pro jednoznačné rozlišení izomerů. ECD jako „měkčí", radikálově řízená technika generovala c-/z-ionty a vedlejší w-ionty, které poskytly specifické signatury izomerů.

Přínosy a praktické využití metody

• Neambiguitní identifikace izomerů v cílové oblasti CDR, což zlepšuje schopnost hodnotit kvalitu a biofunkčnost mAb v raných fázích vývoje i během stability testingu.
• Možnost monitorování tvorby isoaspartátu během stability a při stanovení doby použitelnosti, čímž se zvyšuje spolehlivost posouzení rizik kritických modifikací.
• ECD doplňuje rutinní CID peptidomické workflowy a je zvláště vhodná tam, kde je nutné rozlišit strukturálně podobné zbytky, které CID nedokáže rozhodně rozlišit.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace ECD do standardních hmotově spektrometrických platform pro charakterizaci bioterapeutik, včetně automatizovaných pipeline pro QC a release testy.
• Vývoj softwarových nástrojů pro automatické rozpoznávání w-iontů a interpretaci ECD spekter s cílem zrychlit identifikaci izomerů ve velkých datových sadách peptidových map.
• Rozšíření aplikací ECD na další typy posttranslačních modifikací a na komplexní proteomické analýzy, kde rozlišení izomerů zvyšuje biologickou interpretovatelnost dat.
• Možné kombinace ECD s jinými netradičními MS/MS technikami (např. ETD, UVPD) pro ještě širší spektrum identifikací a zvýšení jistoty při přiřazení modifikací.

Závěr

Použití ECD MS/MS u tryptických peptidů z CDR mAb umožnilo spolehlivě rozlišit izomerické aminokyseliny leucin/isoleucin a aspartát/isoaspartát, což CID samo o sobě nedokázalo. Identifikace isoaspartátu je zvlášť důležitá z hlediska kvality a stability terapeutických protilátek. ECD se tak ukazuje jako cenný analytický nástroj pro charakterizaci mAb během vývoje i stability testingu.

Použitá instrumentace

• LC: Agilent 1290 Infinity II Bio LC s kolonkou AdvanceBio Peptide Mapping C18 (2.1 x 150 mm, 2.7 µm).
• MS: Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Agilent Dual Jet Stream ESI zdrojem a Agilent ExD buňkou pro ECD.
• Software: Agilent MassHunter Qualitative Analysis, Agilent ExDViewer.

Reference

• Vandenborre G., Devloo E., Klein C., Horner-Buxton J., Franklin R., Schneider S., Vandenbussche J., Meersseman M., Sandra P., Sandra K. Identification of Isomeric Amino Acids In The Antigen Binding Region Of A Monoclonal Antibody By Electron Capture Dissociation. Poster Reprint, ASMS 2026, ThP 040. Agilent Technologies, 2026.