Intact Protein Analysis in Plasma Using Automated 2D-LC/TOF with Multiple Heart-Cutting

Analýza intact proteinů v plazmě pomocí automatizovaného 2D-LC/TOF s více režimy heart-cutting

Význam tématu

Analýza intact proteinů a top-down přístup umožňují přesné mapování proteoform, post-translačních modifikací a fragmentů, které se při běžném bottom-up zpracování často ztrácejí. V praxi je přímá analýza intact proteinů v komplexních matricích jako je plazma náročná kvůli velkému dynamickému rozsahu a iontovému potlačení, což obvykle vyžaduje aferentní obohacení. Vývoj neafinitních, ortogonálních separačních strategií umožní rychlejší, univerzálnější a potenciálně kvantitativní přístup vhodný pro výzkum i průmyslové aplikace (farmakokinetika, QC, charakterizace terapeutických protilátek a ADC).

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ukázat, že kombinace prvního dimenzionálního dělení založeného na velikosti (SEC) s druhou dimenzí iontové výměny (IEX) a s přesným, opakovaným heart-cuttingem dokáže izolovat a detekovat intact terapeutické protilátky přímo v čisté lidské plazmě bez použití affinitní enrichace. Modelovými látkami byly trastuzumab (mAb) a jeho ADC T-DM1. Studie demonstrovala citlivost, věrnost hmotnostního určení a schopnost rozlišit glykoformy i distribuci DAR v ADC v komplexní matrici.

Použitá metodika a instrumentace

Souhrn postupu:

• Vzorky: lidská plazma (BioIVT) obsahující spike-in trastuzumabu nebo T-DM1 připravené na 1 µg/µL a následně ředěné v sérii až na 62,5 ng/µL; centrifugace 20 000 × g při 4 °C po 20 min; očista pomocí 30 kDa MWCO ultrafiltračních kazet ve 200 mM ammonium acetátu za zachování objemu.
• První dimenze: velikostní exkluze (SEC) na AdvanceBio SEC 300Å (4.6×300 mm, 2.7 µm) při 0.35 mL/min v 200 mM ammonium acetátu, detekce UV 280 nm; objemy injekce 0.5–10 µL.
• Druhá dimenze: iontová výměna (IEX) na Agilent Bio WAX NP5 (2.1×250 mm), termostatované na 30 °C; mobilní fáze A = 10 mM ammonium acetát, B = 500 mM ammonium acetát; flow 0.2 mL/min; gradienty optimalizované pro trastuzumab a T-DM1 (delší pro trastuzumab, kratší pro T-DM1), s přesným 5:1 ASM faktorem pro převedení mezi dimenzemi.
• Heart-cutting: UV-řízené a multi-heart-cut operace pomocí 2D-LC ventilů s 40 µL Bio smyčkami, umožňující automatické sloučení nebo jednotlivé analýzy frakcí pro vysoce citlivé IEX–MS měření.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent 6230C Accurate Mass TOF LC/MS se zdrojem AJS; typické iontovací parametry zahrnovaly gas temp 325 °C, drying gas 12 L/min, nebulizer 35 psi, sheath gas teploty 275–300 °C, kapilární napětí 5500 V, fragmentor 300 V, skimmer 220 V.
• Softwarové nástroje: MassHunter Acquisition, BioConfirm a MassHunter Qualitative Analysis pro akvizici a dekonvoluci spekter.

Hlavní výsledky a diskuse

Detekce intact trastuzumabu v plazmě:

• Native MS spektrometrie dokázala detekovat intact trastuzumab přímo v neat plazmě při počáteční koncentraci 1 µg/µL bez afinitní enrichace. Glykoformy byly zachovány a identifikovány s vynikající hmotnostní přesností (příklady dekonvoluovaných glykoproteoform: G1F+G0F 3.56 ppm, G1F+G1F −1.27 ppm, G2F+G1F 0.08 ppm, G0F+G0 5.65 ppm; uvedené hodnoty ilustrují přesnost měření v rozsahu jednotek ppm).
• Systém prokázal vysokou analytickou citlivost: intact trastuzumab byl zaznamenán přes sérii ředění od 1 µg/µL do 62.5 ng/µL při zachování rozlišení hlavních glykoform a signálu u 27+ nabitého stavu.

Detekce intact T-DM1 (ADC) v plazmě:

• T-DM1 vykazuje širší heterogenitu (DAR distribuce), která v kombinaci s koelujícími endogenními proteiny ztěžovala přímé rozlišení při jediném rozsahu IEX. Prodloužení gradientu IEX nestačilo k odstranění interferencí.
• Multi-heart-cutting přineslo řešení: jednotlivé frakce SEC byly izolovány a každá analyzována samostatně pomocí vysokorozlišovací IEX–MS, čímž se snížila koeluce a umožnila se detekce T-DM1 s různými DAR (např. pozorované DAR 3 a DAR 4). To ukazuje, že rozdělení vzorku na více cílených frakcí zlepšuje detekci heterogenních intact proteinů v komplexní matrici.

Další pozorování:

• UV-řízené heart-cutting výrazně zrychluje a zjednodušuje vývoj metody, protože první dimenze slouží jako průvodce pro výběr relevantních frakcí k dalším analýzám.
• Systém zachovává nativní strukturu proteinů při přenosu mezi dimenzemi, což je klíčové pro studium proteoform a nekovalentních komplexů.

Přínosy a praktické využití metody

Hlavní přínosy:

• Neafinitní workflow: umožňuje přímou analýzu intact proteinů v plazmě bez nutnosti imunoprecipitace nebo jiného selektivního obohacení.
• Vysoká citlivost a přesnost hmotnostního určení: vhodné pro charakterizaci glykoform, DAR u ADC a obecné proteoform profiling.
• Flexibilita: UV‑guidované a multi-heart-cutting umožňují cílené izolování složitých komponent a optimalizaci pro různé typy analytů (mAb, ADC, komplexní proteinové formace).

Praktické aplikace:

• Charakterizace a stabilita terapeutických protilátek a ADC v maticích biologických vzorků.
• Farmakokinetické studie a monitoring proteoform v preklinických a klinických vzorcích.
• Rychlé prototypování separačních metod v analýze biologických komplexů a výzkumu biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje a rozšíření použití:

• Další integrace automatizace a inteligentního řízení heart-cuttingu pro zvýšení throughputu a reprodukovatelnosti v rutinních workflow.
• Zvýšení rozlišovací schopnosti a citlivosti MS (vyšší rozlišení, lepší transmisní technologie) pro detekci ještě nižších hladin proteoform v komplexních matricích.
• Aplikace v přesné medicíně: sledování specifických proteoform jako biomarkerů, monitoring odpovědi na terapii a detekce léčebných modifikací v reálných klinických vzorcích.
• Rozšíření kombinací separací (např. více typů IEX, kombinace s reverzní fází při zachování nativních podmínek) pro lepší rozlišení velmi heterogenních systémů jako jsou ADC nebo proteiny s rozsáhlými PTM.

Závěr

Prezentovaný 2D-LC/TOF přístup s UV‑řízeným a multi-heart-cuttingem umožňuje přímou, neafinitní analýzu intact proteinů v neat plazmě s uchováním nativního stavu, vysokou citlivostí a vynikající hmotnostní přesností. Metoda je zvlášť užitečná pro charakterizaci glykoform u mAb a pro rozlišení heterogenních populací u ADC, přičemž nabízí hodnotnou alternativu k pracným obohacovacím postupům a slibuje široké nasazení v biofarmaceutickém výzkumu a kontrole kvality.

Reference

1. Fischer MS, et al. Native Top-Down Proteomics of Endogenous Protein Complexes Enabled by Online Two-Dimensional Liquid Chromatography. Anal Chem. 2025.
2. Lambert JM, et al. Ado-trastuzumab Emtansine (T-DM1): An Antibody–Drug Conjugate (ADC) for HER2-Positive Breast Cancer. J Med Chem. 2014.