Supercritical Fluid Chromatography MS/MS Method Development for the Analysis of GLP-1 Analogues

Význam tématu

GLP-1 agonisté (např. liraglutid, semaglutid) jsou vysoce relevantní biologické léčivé látky s rostoucím klinickým i komerčním významem. Analytická separace a kvantifikace těchto molekul je výzva: současně obsahují peptidové i lipofilní motivy, které komplikují retenční chování. Superkritická fluidní chromatografie (SFC) nabízí potenciální výhody oproti HPLC — zejména rychlejší analýzy a výrazně nižší spotřebu organických rozpouštědel — avšak její širší adopce je limitována nedostatkem jasných doporučení pro volbu stacionární fáze a optimalizaci parametrů. Studie se snaží poskytnout praktický návod pro vývoj SFC–MS metod pro analýzu GLP‑1 analogů a tím snížit bariéry pro zavedení této techniky v rutinních laboratořích.

Cíle a přehled studie / článku

• Provést screening běžně používaných SFC stacionárních fází pro separaci GLP‑1 analogů.
• Optimalizovat parametry SFC metod kompatibilních s LC–MS (výběr modifikátoru, průtok, teplota, BPR apod.).
• Demonstrativně prokázat kvantitativní výkon (linearity, citlivosti) pro liraglutid a semaglutid za SFC–MS podmínek.

Studie používá standardy liraglutidu a semaglutidu rozpuštěné v methanolu, separace probíhala na analytickém SFC Nexera spojeném s triple‑quadrupole LCMS‑8050.

Použitá metodika a instrumentace

Ultrakrátké shrnutí metodiky:

• Vzorek: standardy liraglutidu a semaglutidu v 100% methanolu.
• Mobilní fáze: superkritický CO2 s methanolovými směsmi jako modifikátorem; běžně použitý gradient 5 % → 85 % organické fáze pro rychlou eluci.
• Průtok: analytická separace provedena při 1,1 mL/min; pomocný (makeup) průtok 0,1 mL/min obsahoval methanol s 0,1 % kyselinou mravenčí pro zlepšení ionizace.
• Podmínky BPR a teploty: uvažovány provozní tlaky a teploty běžné pro SFC (v práci použit BPR 150 bar při 50 °C a teplota kolony ~68 °C).

Použitá instrumentace (samostatná sekce podle dokumentu):

• Shimadzu Nexera Analytical SFC systém.
• Shimadzu LCMS‑8050 Triple‑Quadrupole mass spectrometer pro MRM akvizici.
• Testované analytické kolony: řada stacionárních fází zahrnující C18, fenyl, cyanopropyl, diol, cholesteryl, pyridinyl a poly(4‑vinyl pyridin) (DCPak® P4VP).
• Vybraný sloupec pro kvantifikaci: DCPak® P4VP (poly(4‑vinyl pyridin)).
• Optimalizace MS prováděna pomocí flow injection analysis (FIA) pro nastavení ionizačních a desolvačních parametrů před chromatografickým screenem.

MRM a ionizační poznámky:

• Pro liraglutid byl identifikován hlavní prekurzor v okolí m/z 938,8; vybrané produktové ionty zahrnovaly signály v oblasti ≈1128,6, 1064,3 a 935,9. Pro semaglutid byly použity prekurzory v rozsahu přibližně m/z 1029–1251 s odpovídajícími produktovými ionty.
• Kolizní energie pro jednotlivé přenosy byla optimalizována empiricky, v použitých přenosech se pohybovala zhruba v rozsahu -26 až -57 (jednotky CE nastavení zařízení).

Hlavní výsledky a diskuse

• Ze screenovaných stacionárních fází poskytla nejlepších chromatografických výsledků poly(4‑vinyl pyridin) (P4VP) — tento sloupec vedl k nejpříznivějšímu tvaru píků a reprodukovatelné separaci obou GLP‑1 analogů.
• Mezi testovanými modifikátory se methanol jevil jako nejuniverzálnější a nejvíce citlivý pro MS detekci. Přidání 2‑propanolu a drobného množství vody mělo lokální efekty na intenzitu signálu u některých přenosů, avšak celková linearita a citlivost zůstaly obdobné.
• Přidání isopropanolu (2‑propanolu) zvyšovalo provozní tlak (ořádově ~100 psi), což je třeba brát v úvahu z hlediska limitů přístroje a stability eluce.
• Optimalizace MS parametrů před chromatografickým screeningem (přes FIA) byla klíčová: po nastavení optimální ionizace a desolvačních podmínek bylo možné změny v signálu bezpečně připsat chromatografii, nikoli mass‑spectrometrii.
• Kvantifikace: metoda vykazovala dobrou linearitu pro oba analyty (R² ≈ 0,989 v rozsahu prokazovaném autory, grafy kalibrace do cca 50 ppm). To potvrzuje vhodnost SFC–MS pro kvantitativní aplikace s GLP‑1 peptidy.

Přínosy a praktické využití metody

• SFC–MS s P4VP fází představuje životaschopnou alternativu k běžnému HPLC–MS pro analýzu peptidických léčiv typu GLP‑1: nabízí kratší doby analýzy a nižší spotřebu organických rozpouštědel.
• Metoda je kompatibilní s rutinou kvantifikace v průmyslových i akademických laboratořích (QC, vývoj formulací, stabilitní studie), zvláště tam, kde jsou výhody rychlosti a nižší spotřeby rozpouštědel žádoucí.
• Doporučený pracovní postup pro vývoj metody: nejprve optimalizovat MS parametry (FIA), poté provést screening stacionárních fází a následně jemnou optimalizaci modifikátoru a gradientu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace SFC pro širší třídu peptidů a peptid‑lipopeptidů, které vykazují smíšené hydrofobní a hydrofilní vlastnosti.
• Další systematické studie zaměřené na relační chování modifikátorů (poměry methanol/IPA/voda) a jejich vliv na ionizační efekt a tlaky v systému s cílem optimalizovat kompromis mezi citlivostí a provozní robustností.
• Integrace SFC do rutinních workflow v biofarmaceutickém vývoji jako doplňková nebo náhradní technika vůči HPLC, obzvlášť tam, kde jsou environmentální a provozní náklady důležité.
• Vývoj standardizovaných doporučení pro volbu kolony podle struktury analyzovaného peptidu by zpřístupnil SFC širšímu okruhu uživatelů.

Závěr

Studie ukazuje, že SFC–MS je vhodnou metodou pro separaci a kvantifikaci GLP‑1 analogů. Poly(4‑vinyl pyridin) (DCPak® P4VP) sloupec spolu s methanolovými modifikátory poskytuje nejlepší kompromis mezi chromatografickým výkonem a citlivostí v MS. Optimalizace ionizačních podmínek pomocí FIA před chromatografickým screeningem se ukázala jako efektivní strategie vývoje metody. Celkově SFC nabízí rychlé, citlivé a méně náročné alternativní řešení k tradičním HPLC postupům, vhodné pro rutinní i vývojové aplikace v oblasti peptidových léčiv.

Reference

• Shimadzu Scientific Instruments. General overview of SFC. 2026. (technická přehledová publikace Shimadzu)
• Shimadzu Scientific Instruments. Peptide therapeutics — application notes. 2026. (produktová/aplikační dokumentace)
• West C., Schad G. Supercritical Fluid Chromatography for Dummies. 1st ed., 2025.