Multi-Method Drug Analysis in Human Plasma Using Fault-Tolerant High-Throughput LC-MS/MS System

Vícemetodová analýza drog v lidské plazmě pomocí odolného vysokoprůtokového LC‑MS/MS systému

Význam tématu

• Rychlé a spolehlivé kvantitativní stanovení léčiv a drog v biologických matricích je klíčové pro forenzní a klinické laboratoře, kde se zpracovávají velké objemy vzorků.
• Hlavní praktické výzvy zahrnují mezivzorkovou kontaminaci (carryover), odstávky při údržbě a vliv matice na citlivost a přesnost analýzy.
• Systémy kombinující multiparalelní chromatografii a integrované online SPE mohou tyto překážky zmírnit a významně zvýšit průchodnost práce bez snížení analytické kvality.

Cíle a přehled studie

• Cílem bylo ověřit výkon čtyřkanálového (multiplex) LC‑MS/MS uspořádání při současné analýze 26 cílových sloučenin v lidské plazmě.
• Hodnoceny byly kvantitativní parametry (linearity, přesnost), robustnost při vysokém objemu vzorků a zvýšení průchodnosti díky paralelnímu provozu nezávislých LC cest a integrovanému online SPE.

Použitá instrumentace

• Multiplexní LC systém: Nexera QX (čtyři sady binárních pump a autosamplerů), řízené softwarem QX Solution.
• Hmotnostní spektrometr: LCMS‑8060RX (ionizace ESI).
• Online SPE kolony: MAYI 2 C18‑60 (trap, 50 × 1.0 mm I.D.) a MAYI 2 WCX (ion‑exchange trap, 50 × 1.0 mm I.D.).
• Analytická kolona: Shim‑pack Scepter C18‑120 (50 × 2.1 mm, 3.0 µm), teplota 40 °C.
• Další provozní parametry: ESI, nastavené toky plynů a teploty heat‑block/daového rozptylu; mobilní fáze kyselina mravenčí 0,1 % ve vodě / methanol.

Použitá metodika

• Vzorkování a předúprava: směsné lidské plazmy, proteinová precipitace přidáním acetonitrilu v poměru 3:1 (300 µL ACN na 100 µL plazmy), centrifugace 10 000 rpm / 10 min, následné smíchání supernatantu s interními/standardními roztoky k přípravě QC.
• Online SPE workflow: analýza probíhá tak, že analyty jsou zachyceny na trap kolónách (C18 nebo WCX podle chemických vlastností), poté elutovány do analytické kolony a separovány gradientem; mezi běhy se provádí mytí a re‑equilibrace oddělených cest.
• Multiplexní provoz: systém používá čtyři nezávislé proudy (streamy) napojené na jediný MS; dva streamy pracují s C18 trapem a dva s WCX, což umožňuje současné provádění dvou rozdílných metod bez nutnosti výměny kolon nebo mobilních fází.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearity: Kalibrační křivky pro všech 26 analyzovaných sloučenin vykazovaly koeficienty determinace r2 > 0,99, což potvrzuje velmi dobrou linearitu v deklarovaných rozsazích.
• Dynamické rozsahy: stanovené rozsahy se pohybovaly typicky v nízkých jednotkách až do 10 000 ng/L (ppt), lišící se podle konkrétní sloučeniny a ionizačních vlastností.
• Přesnost a QC: kvantitativní přesnost QC vzorků byla v rozmezí přibližně 80–115 % pro všechny analyty, tedy splněny přijatelné kritéria přesnosti pro většinu forenzních/klinických aplikací. Některé analyty vykázaly hodnoty blíže střední hodnotě (≈90–106 %), jiné byly na dolní hranici (≈80–87 %), což odráží rozdílnou retenci a ionizační efektivitu.
• Robustnost a carryover: oddělené čtyři proudy a izolace autosamplerů významně snižují riziko mezivzorkové kontaminace a umožňují pokračovat v provozu jedné nebo více cest i při problémech na jiné větvi — tedy vyšší odolnost proti výpadkům.
• Zvýšení průchodnosti: simulace ukázala, že paralelní práce dvou metod na čtyřech proudech dosahuje až ~60% zlepšení průtoku oproti konvenčnímu LC‑MS postupu vyžadujícímu ~9,3 minuty na vzorek. Tento zisk plyne z eliminace časově náročných kroků mytí a re‑equilibrace mezi metodami.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zvýšení throughputu bez výrazného kompromisu v analytické kvalitě dělá systém vhodný pro forenzní laboratoře, toxikologii a klinické studie s vysokým počtem vzorků.
• Online SPE integrované do multiplexního workflow minimalizuje ruční manipulaci, omezuje vliv matice a zlepšuje citlivost pro nízké koncentrace analytů.
• Nezávislé kanály umožňují současné provozování metod s odlišnými retenčními mechanismy (reverse‑phase a ion‑exchange), čímž se zvyšuje flexibilita metodologie a snižuje provozní režie při změnách analyzovaných souborů látek.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Dále se očekává nasazení podobných multiplexních architektur pro jiné matice (moč, tkáně) a pro rozšířené panely analyzovaných látek, včetně metabolitů a nových psychoaktivních látek.
• Integrace pokročilého řízení chyb a automatické diagnostiky by mohla ještě zvýšit „fault‑tolerance“ a minimalizovat doby odstávek.
• Vylepšení datové analýzy a automatizované kvantifikace (větší využití softwarového workflow) umožní rychlejší validaci a reporting výsledků v režimech vysoké propustnosti.
• Možnosti další optimalizace zahrnují jemné doladění online SPE protokolů a využití dalších typů selektivních sorbentů pro redukci matičných interferencí u obtížných analytů.

Závěr

• Prezentovaný 4kanálový LC‑MS/MS systém s integrovaným online SPE prokázal vysokou linearitu, akceptovatelnou přesnost QC a schopnost zpracovat větší počet vzorků při sníženém carryover a zkrácených režimech mytí/equilibrace.
• Koncept paralelních, izolovaných LC cest umožňuje značné zvýšení průchodnosti laboratorních workflow a zlepšuje provozní odolnost — klíčové faktory pro forenzní a klinické laboratoře zpracovávající vysoké objemy vzorků.
• Produkty a aplikace uváděné ve studii jsou určeny pro výzkum (RUO) a nejsou schváleny pro diagnostické použití.

Reference

• Suzuki Y., Imoto E., Miller L., Sato S., Johnson V. MP 205. Multi‑Method Drug Analysis in Human Plasma Using Fault‑Tolerant High‑Throughput LC‑MS/MS System. Shimadzu Scientific Instruments / Shimadzu Corporation. (prezentace, RUO)