Expanding plasma metabolome coverage with enhanced dynamic range and iterative MS/MS acquisition on Orbitrap Excedion mass spectrometer

Význam tématu

Rozsáhlý dynamický rozsah krevní plazmy představuje zásadní omezení pro untargeted LC-HRAM-MS metabolomiku: vysoce abundantní ionty dominují akumulaci nábojů a omezují detekci i MS/MS fragmentaci nízkointenzitních metabolitů. Zlepšení rozložení doby iontové injekce (ion injection time, IT) v rámci full-scan měření může zásadně zvýšit poměr signál/šum (S/N) pro slabší signály a tím rozšířit použitelný metabolomický prostor pro identifikace a anotace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyhodnotit režim enhanced dynamic range (eDR) na Orbitrap Excedion MS, v kombinaci s AcquireX iterativním DDA (Deep Scan), pro zlepšení pokrytí plazmového metabolomu a kvality MS/MS anotací (mzCloud). Studie porovnává eDR vs konvenční full-scan při třech zatíženích plazmovým ekvivalentem a zkoumá vliv přerozdělení IT a šířky MS2 izolace na počet kvalitních MS1 entit a přísně filtrovaných mzCloud shod.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorky: NIST SRM 1950 plazma, extrakce metanolovou precipitací, centrifugace, evaporace a rekonstituce; více ředění/injekčních objemů normalizovaných na plazmový ekvivalent (0,58; 1,44; 4,33 µL ekvivalentu na koloně).
• Chromatografie: Vanquish Horizon UHPLC se sloupcem Hypersil GOLD VANQUISH C18 (150 × 2,1 mm, 1,9 µm).
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Orbitrap Excedion; MS1 m/z 67–1000, rozlišení 120 000. eDR rozděluje MS1 do 16 oken pro optimalizaci akumulace iontů.
• DDA/MS2: AcquireX iterativní Deep Scan s krokovaným normalizovaným HCD 10/35/60 %; MS2 izolační šířky 0,4–2,0 Da; sekvence obsahovaly blank-exclusion listy a několik referenčních MS1 injekcí.
• Zpracování dat: Thermo Scientific Compound Discoverer 3.5 a FreeStyle 1.8 SP2.

Kritéria kvality pro výsledky:

• MS1 filtry: CV <20 %, přidělení sumárního vzorce, peak rating >6 v referenčních replikách.
• MS2/mzCloud filtry (přísné): CV <20 %, nenulové přidělení vzorce, peak rating ≥6 v 3/3 MS1 replikách, mzCloud skóre ≥60, MS2 spectral purity >60.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní poznatky:

• eDR zvýšila počet kvalitně filtrovaných MS1 entit napříč všemi testovanými plazmovými zátěži; největší absolutní i relativní zisk byl při nejvyšším zatížení (4,33 µL): 6 619 entit vs 1 591 u konvenčního full-scan (+316 %).
• V přísně filtrovaných MS2 výsledcích (mzCloud) eDR rovněž vedla k nárůstu: při nejvyšším zatížení 859 shod vs 509 u konvenčního full-scan (+69 %).
• Mechanismus: eDR přerozděluje IT směrem k nižšímabundantním iontům zvýšením akumulační doby v m/z oknech, kde je signál slabý, čímž zvyšuje S/N. Ukázkový případ cortisone demonstroval zvýšení S/N a významné prodloužení IT u slabších signálů; u vysoce abundantních iontů je IT redukována a čas je přesunut tam, kde je potřeba.
• Optimalizace MS2 izolace: zúžení izolační šířky na 0,4 Da výrazně zvýšilo selektivitu prekurzoru a snížilo ko‑izolaci, což vedlo k čistším MS/MS spektrům a vyšším mzCloud skóre u molekul s m/z < 400. Příklad: paracetamol — MS2 purity se zvýšila z 45 na 95 a spektrum bylo významně čistší.
• Chromatografie: fenylalanin použitý jako kontrola ukázal stabilní tvar píku a RT mezi 0,58–4,33 µL, což svědčí o zachování chromatografické kvality i při vyšších zátěžích.

Diskuze: výsledky potvrzují, že eDR efektivně rozkládá akumulační čas tak, aby se minimalizovalo podvzorkování nízkoabundantních složek. Kombinace eDR s AcquireX iterativním DDA zvyšuje hloubku anotací a počet vysokokvalitních library shod bez nutnosti kompromisu v rozsahu MS1 snímání.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy:

• Zvýšení citlivosti a počtu identifikovatelných metabolitů v komplexních biofluidních vzorcích, zejména při vyšších injekčních dávkách.
• Vyšší kvalita MS2 spekter umožňuje lepší důvěru v knihovní anotace (mzCloud) a tím i robustnější biologické interpretace a biomarker discovery.
• Možnost zvýšit analytickou hloubku bez nutnosti složitých chemických frakcí nebo dalších separačních kroků; zlepší throughput v rozsáhlých studiiách.
• Vhodné pro laboratoře zabývající se untargeted metabolomikou, farmakometabolomikou a biomarkerovými studiemi, kde je důležité zachytit nízkoabundantní signály.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a aplikací:

• Další jemná optimalizace rozdělení m/z oken a adaptivní (real‑time) přizpůsobení IT na základě momentálního spektra by mohla zvýšit výkonnost eDR.
• Integrace s iontově‑mobilitní separací pro další rozlišení ko‑elujících izobarických složek.
• Rozšíření knihoven spekter a použití strojového učení pro zlepšení automatické anotace čistějších MS2 spekter.
• Hodnocení kvantitativních aspektů eDR a jeho dopadu na přesnost a linearitu kvantifikace při vyšších zatíženích.
• Využití v klinických kohortách a studii s nízkoabundantními biomarkery, kde zvýšená hloubka dat přináší vyšší diagnostickou hodnotu.

Závěr

Režim eDR na Orbitrap Excedion, v kombinaci s AcquireX iterativním DDA, výrazně rozšiřuje použitelné pokrytí plazmového metabolomu tím, že inteligentně přerozděluje dobu iontové injekce k slabějším iontům a tím zvyšuje S/N a počet kvalitních MS1 entit i mzCloud MS2 shod. Dále, zúžení MS2 izolační šířky výrazně zlepšuje čistotu spekter a kvalitu knihovních anotací. Metoda nabízí praktický přínos pro untargeted metabolomiku a má potenciál pro další zlepšení prostřednictvím adaptivních strategií a kombinace s dalšími separačními technikami.

Reference

• Kaczmarek M., Amer B., Deshpande R., Bird S. Expanding plasma metabolome coverage with enhanced dynamic range and iterative MS/MS acquisition on Orbitrap Excedion mass spectrometer. Thermo Fisher Scientific application note, 2026.
• Instrumentace a software citované ve studii: Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC, Hypersil GOLD VANQUISH C18 column, Orbitrap Excedion Mass Spectrometer, AcquireX Deep Scan workflow, Compound Discoverer 3.5, FreeStyle 1.8 SP2.