A ready-to-run workflow for quantitating 80 drugs of abuse in whole blood with the TSQ Certis Triple Quadrupole MS

Význam tématu

Shrnutí popisuje praktický, rychlý a validovatelný analytický tok pro kvantifikaci 80 látek zneužívaných drog v lidské plné krvi pomocí kapalinové chromatografie spojené s triplekvadrupólovým hmotnostním spektrometrem TSQ Certis. Takové workflowy jsou klíčové pro forenzní a toxikologické laboratoře, kde je potřeba současně dosahovat vysoké citlivosti, reprodukovatelnosti, krátkých časů analýzy a souladu s normami (např. ANSI/ASB). Zvýšená kapacita instrumentů a optimalizované předúpravy umožňují zrychlení vyšetření bez ztráty kvality výsledků, což má přímý dopad na provozní efektivitu v laboratorním provozu a rozhodování v právní či klinické oblasti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vytvořit a demonstrovat fungující end-to-end metodu pro potvrzení a kvantifikaci 80 analyzovaných drog v plné krvi s dosažením limitů stanovených normami (LOQ) a širokého lineárního rozsahu až do 500 ng/mL. Studie zahrnovala přípravu kalibrací, optimalizaci extrakce, chromatografie i hmotnostní detekce a ověření citlivosti, obnovy a robustnosti metody.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika – klíčové kroky:

• Příprava kalibrací: 13 kalibračních hladin v rozsahu 0,05–500 ng/mL v plné krvi; objem vzorku 100 µL; použití směsi 80 standardů.
• Interní standardy: 15 µL směsi značených interních standardů odpovídajících analyzátům byl přidán ke každému vzorku.
• Proteinová precipitace a předčištění: „Soft crash“ 25 µL 1% ZnSO4, vortex 15 s, následně 300 µL acetonitrilu a vortex 60 s pro precipitaci proteinů.
• Filtrace/extrakce: INTip Filtration (Tip‑on‑Tip, DPX Technologies) – aspirace skrz filtraci v běžném 1000 µL pipetovacím hrotem do čisté zkumavky.
• Sušení a rekonstituce: sušení 50 °C po 14 minutách; rekonstituce nejprve 20 µL MeOH + 0,1% kyseliny mravenčí + 2 mM NH4 formiát, promíchání, pak doplnění 80 µL vody s 0,1% kys. mrav. + 2 mM NH4 formiát (MeOH přidávat první kvůli zajištění rozpustnosti THC).

Instrumentace – samostatná sekce byla uvedena níže.

Použitá instrumentace

• Kapalinová chromatografie: Thermo Scientific Vanquish Horizon UHPLC; kolona Accucore Biphenyl, 2,1 × 50 mm, 2.6 µm.
• Mobilní fáze: A i B: voda a methanol, obě obsahují 0,1% kyseliny mravenčí a 2 mM amoniového formiátu; objem injekce 1 µL; doba analýzy 4,5 minuty s gradientem umožňujícím rozlišení isomerů.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific TSQ Certis triple kvadrupól; režim SRM (selected reaction monitoring); Q1 rozlišení 0,7 FWHM, Q3 1,2 FWHM; 2 transitions na analyt pro potvrzení; seznam SRM obsahoval RT, prekurzor a produktová m/z, RF lens a CE.
• Ionizace: OptaMax Plus HESI zdroj s možností zvýšených teplot vaporizeru (optimalizováno až na 500 °C pro zvýšení signálu u řady analyzátů).
• Výkon: přístroj podporuje vysoké rychlosti akvizice (>900 SRM/s) a přepínání polarity <5 ms, což umožňuje sběr dostatečného počtu bodů na eluci i při velmi krátkých špičkách (2 ms/transition byl použit k dosažení požadované citlivosti).

Hlavní výsledky a diskuse

• Citlivost: Stanovené LOQ dosahovaly až 0,05 ng/mL pro vybrané anality; většina analyzátů měla LOQ v rozsahu 0,05–0,5 ng/mL v závislosti na sloučenině.
• Lineární rozsah: ULOL až 500 ng/mL pro většinu sloučenin, při čemž kalibrace byla stanovena na 13 úrovních mezi 0,05 a 500 ng/mL.
• Chromatografie: 4,5minutový běh umožnil separaci kritických izomerů (např. codein/hydrokodon, morphin/hydromorfon, methamphetamine/phentermine), což je zásadní pro forenzní identifikaci.
• Obnova: Průměrná procentuální obnova přes 80 analyzátů byla 96,92%; nejnižší změřená obnova byla 82,39%.
• Vliv teploty vaporizeru: Zvýšení teploty vaporizeru přineslo až dvojnásobné zvýšení plochy píku u některých látek, čímž se zlepšila citlivost metody.
• Robustnost a reprodukovatelnost: Při sérii >450 injekcí byly plochy špiček (příklad lorazepam) v rozmezí ±20% RSD; metoda tedy poskytuje stabilní výsledky pro vysokopropustné nasazení.
• Protokol potvrzení: Ion‑ratio tolerance ±20% vůči průměru kalibrátorů byla použitá jako kritérium pro potvrzení přítomnosti analytů; metoda používala dvě transitions pro potvrzení identity.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká propustnost: 4,5minutový běh umožňuje zpracování přibližně 320 vzorků za den na jedno pracoviště, což výrazně zvyšuje laboratorní kapacitu.
• Široké pokrytí: Metoda pokrývá 80 běžně sledovaných drog a metabolitů, vhodné pro forenzní, toxikologická a kontrolní centra.
• Řešení problémů s matricí: Kombinace precipitace proteinů a INTip Filtration poskytuje vysoce reprodukovatelné výsledky a vysoké obnovy i v komplexní matrici plné krve.
• Flexibilita instrumentace: Rychlá SRM akvizice a rychlé přepínání polarity umožňují současné měření sloučenin s různými ionizačními charakteristikami bez kompromisů v citlivosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření panelu: Integrace dalších analyzátů nebo metabolitů do stejného workflowu bez zásadních změn chromatografie či akvizice.
• Automatizace předúpravy: Plně automatizované pipetovací/moduly s INTip technologií by mohly dál zvýšit reprodukovatelnost a throughput.
• Měrná citlivost a miniaturizace: Optimalizace zdrojových parametrů a novějších ionizačních technik může dále snížit LOQ a zlepšit detekci stopových látek.
• Standardizace a validace pro forenzní účely: Rozšířená mezi-laboratorní validace a případné přizpůsobení metodiky pro oficiální normy a akreditace.
• Využití vysokorychlostních akvizic pro komplexní screening: Kombinace SRM se screeningovými přístupy (HRMS) pro širší pokrytí neznámých látek.

Závěr

Popsaný workflow představuje rychlé, citlivé a robustní řešení pro kvantifikaci 80 drog v plné krvi. Díky optimalizované předúpravě (proteinová precipitace + INTip Filtration), 4,5minutové chromatografii na biphenylové kolóně a výkonnému SRM režimu TSQ Certis MS lze dosahovat LOQ do 0,05 ng/mL, průměrné obnovy ~97 % a vysoké denní propustnosti ~320 vzorků. Metoda je vhodná pro forenzní a toxikologická pracoviště, která vyžadují rychlý, reprodukovatelný a regulacím vyhovující screening a kvantifikaci látek zneužívání.

Reference

1. Patterson C., Hassell K., Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA, USA. A ready-to-run workflow for quantitating 80 drugs of abuse in whole blood with the TSQ Certis Triple Quadrupole MS. Thermo Fisher Scientific, 2026.