Automated Cyclic Ion Mobility–Mass Spectrometry MS/MS Workflow and Data Analysis for Shotgun Lipidomics

Význam tématu

Masová spektrometrie lipidů je klíčová pro pochopení buněčné biologie, biomarkerů a fází onemocnění. Přidání iontové mobility (IM) poskytuje další rozměr separace, který je zvláště cenný při řešení izobarických a izomerických překryvů v komplexních lipidomických směsích. Zvýšení analytické přesnosti u přímé infuze (shotgun) lipidomiky umožní citlivou identifikaci a kvantifikaci i v omezených vzorcích (až na úroveň single-cell) a zlepší výklad lipidových profilů pro biomedicínský a průmyslový výzkum.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje integraci cyklické iontové mobility (cIM) do shotgun lipidomické workflows a představuje zautomatizované akviziční a datové zpracování pro dvourozměrná data (m/z a driftový čas) pro MS1 i MS2 s kvadrupólem selektovanými prekurzory (Q-cIM-MS/MS). Proof-of-principle experimenty měly ukázat, že cIM zlepšuje jasnost spekter a rozlišení izobarů/izomerů, a zároveň že je možné data automatizovaně zpracovat a anotovat pro větší soubory vzorků.

Použitá metodika

Popisovaná metoda kombinuje přímou infuzi s cyklickou iontovou mobilitou a tandemovou MS (Q-cIM-MS/MS). Hlavní body metodiky:

• Příprava vzorku: pět nezávislých lipidových extrakcí pomocí přizpůsobeného MTBE protokolu; extrakty ředěny v MS-mixu 1/20 bez chromatografické separace.
• Akvizice: direct infusion cIM-MS a Q-cIM-MS/MS v pozitivním i negativním ionizačním režimu; akvizice v HDMS a HDMS/MS (v-mode).
• Ionizace: nano-ESI pomocí Triversa NanoMate (Advion), parametrizace přibližně 1.1 kV při 1.0 psi, teplota zdroje 150 °C.
• Experimentální návrh: semi-automatizované metody sestavené v Cyclic IMS Method Editoru; demonstrace single-pass cIM experimentů.

Použitá instrumentace

Instrumentace a softwarové nástroje využité ve studii:

• SELECT SERIES Cyclic IMS (Waters Corporation) s cIM array konfigurací.
• Nano-ESI Triversa NanoMate (Advion) pro direct infusion.
• MassLynx v4.2 a DriftScope 3.0 pro akvizici a vizualizaci dat.
• ApexRT 1.17 pro multidimenzionální detekci píků; vlastní Python skripty s pandas a numpy pro výpočty driftového času/CCS.
• Informační nástroje: prototyp LipidXplorer 1.5 a lxPostman pro MFQL založenou identifikaci lipidů a postprocessing.

Hlavní výsledky a diskuse

Hlavní zjištění a interpretace dat:

• cIM významně zlepšuje rozlišení izobarických a izomerických lipidních signálů, což snižuje spektrální komplexitu při shotgun přístupu. Příklady ukazují, že fragmentní ionty s charakteristickým m/z (např. FR 184.07) lze rozlišit podle driftového času, kde konvenční m/z-only analýza selhává.
• Integrace Q-cIM-MS/MS vedla k získání čistších MS/MS spekter pro kvadrupólem izolované prekurzory; v příkladech bylo možné potvrdit a anotovat konkrétní lipidní třídy a izomery (např. rozlišení PC vs. PC-O, potvrzení SM druhů).
• Automatizovaný workflow dokáže v krátkém čase (ukázka: ~250 Q-cIM-MS/MS akvizic za 6 minut) generovat 2D profil (m/z vs. driftový čas) a automaticky detekovat multidimenzionální features pro následnou identifikaci a kvantifikaci.
• V proof-of-principle experimentu bylo kvantifikováno 166 lipidů rozdělených do osmi tříd pomocí pozitivního ionizačního shotgun přístupu, včetně triglycerydů (TG) zobrazených v 2D mapách a kvantitativních výsledků s přijatelnou reprodukovatelností.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy implementace cIM v shotgun lipidomice:

• Výrazné zlepšení schopnosti rozlišit izobary a izomery bez časově náročné chromatografie, což šetří čas a materiál.
• Zvýšená jistota lipidové anotace díky kombinaci m/z, driftového času a MS/MS fragmentace; lepší identifikace ve složitých matricích (např. plazma).
• Automatizovatelné workflow usnadňuje škálovatelnost pro větší soubory vzorků a rutinní aplikace v laboratořích kvality a výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti rozvoje a aplikací vyplývající ze studie:

• Rozšíření akvizice Q-cIM-MS/MS do obou ionizačních režimů (pozitivní i negativní) a širšího seznamu inkluzí ke zvýšení krytí lipidů.
• Integrace 2D feature listů do standardizovaných databází a aktualizace softwaru (LipidXplorer, lxPostman) pro plně multidimenzionální MasterScan generaci a hromadné anotace.
• Pokračující práce na zkrácení akviziční doby a zdokonalení single-cell lipidomiky s využitím cIM pro ještě citlivější analýzy.
• Potenciál pro aplikace v klinických studiích, biomarker discovery a průmyslových QA/QC procesech, díky rychlosti, reprodukovatelnosti a lepší selektivitě.

Závěr

Studie demonstruje, že přidání cyklické iontové mobility do shotgun lipidomického workflow významně zvyšuje schopnost rozlišit izobarické a izomerické lipidní species bez nutnosti chromatografie. Navržený automatizovaný akviziční a datový pipeline umožňuje efektivní zpracování dvourozměrných (m/z a driftový čas) dat pro MS1 i MS2, což vede k přesnější identifikaci a kvantifikaci lipidů v komplexních vzorcích. Metoda je škálovatelná a připravená k dalšímu rozšíření pro větší kohorty a širší aplikační spektrum.

Reference

1. Giles K, Williams JP, Campuzano I. A Cyclic Ion Mobility–Mass Spectrometry System. Analytical Chemistry. 2019.
2. Matyash V, Liebisch G, Kurzchalia T, Shevchenko A, Schwudke D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 2008.
3. Herzog R, Schwudke D, Schuhmann K, Sampaio JL, Bornstein SR, Schroeder M, Shevchenko A. A novel informatics concept for high-throughput shotgun lipidomics based on the molecular fragmentation query language. Genome Biology. 2011.
4. lxPostman / LIFS-tools. Nástroj pro postprocessing a integraci LipidXplorer výsledků (webový nástroj pro multidimenzionální lipidomiku).