A Fully Integrated Qual/Quan Solution from a Single Injection Using Standardized Sample Preparation and Chromatography with a Benchtop MRT Mass Spectrometer

Integrované Qual/Quan řešení z jediné injekce pomocí standardizované přípravy vzorku a chromatografie na benchtop MRT

Význam tématu

Propojení rozsáhlé kvalitativní charakterizace (discovery) a přesné cílené kvantifikace v jedné LC–MS analýze řeší klíčové provozní problémy moderních laboratoří: snižuje spotřebu vzorku, zkracuje čas na analýzu a eliminuje variabilitu spojenou s vícenásobnými injekcemi. Taková integrace je zvláště důležitá pro vysokopropustné, rutinní a longitudinální studie, kde je kritická opakovatelnost a stabilita dat napříč stovkami vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo ukázat praktickou implementaci „mixed mode“ workflow, který v jedné injekci kombinuje data‑independent acquisition (MSe) pro kvalitativní analýzu a plánované Tof MRM pro cílenou kvantifikaci. Demonstrace proběhla na přístroji Xevo MRT P10 v kombinaci se standardizovanou chromatografií Evosep a automatizovanou přípravou vzorků, s důrazem na udržení kvality obou datových proudů bez zhoršení časového rozlišení chromatografických píků.

Použitá metodika a instrumentace

Popis vzorku a přípravy:

• Standard peptidů vznikl tryptickou digescí čtyř proteinů smíchaných v ekvimolárním poměru a byl přimíchán do komplexního E. coli tryptického digestu jako matice.
• Automatizovaná příprava a nabíjení Evotipů proběhlo pomocí pipetovacího robota Andrew+, čímž se minimalizovala variabilita manuální manipulace a zajišťovalo konzistentní desaltování a cleanup.

Chromatografie:

• Evosep Eno se standardizovanými metodami; použit byl režim 60 samples‑per‑day (SPD) s celkovým cyklem 24 minut (gradient, wash, equilibration).
• Systém pracuje s předem připravenými gradienty a disposable trap‑loadingem pro vysokou reprodukovatelnost retencí.

Hmotnostní spektrometrie a akvizice:

• Xevo MRT P10 Mass Spectrometer v mixed mode: současné získávání MSe (DIA) pro untargeted analýzu a plánované Tof MRM přechody pro cílenou kvantifikaci.
• Bylo sledováno deset předdefinovaných marker peptidů pomocí více než 30 Tof MRM přechodů v jedné injekci.
• Rychlý multi‑reflecting TOF umožnil dostatečnou rychlost akvizice pro paralelní sběr obou režimů bez prodloužení chromatografického cyklu.

Zpracování dat:

• Targetovaná MRM data zpracována v aplikaci MS Quan v rámci waters_connect pro automatizované kvantitativní vyhodnocení a řízení batchí.
• Untargeted MSe data konvertována do mzML a zpracována pomocí DIA‑NN pro identifikace proteinů a kvalitativní hodnocení.

Hlavní výsledky a diskuse

• Smíšená akvizice v jedné 24minutové analýze úspěšně kombinovala DIA a Tof MRM bez zhoršení tvaru chromatografických píků nebo jejich integrace, i při překrývajících se akvizičních událostech.
• Retenční časy peptidů na Evosep Eno v režimu 60 SPD byly vysoce stabilní, s odchylkou ±2 s vůči průměru napříč opakovanými injekcemi — což podporuje plánované (scheduled) MRM režimy bez častých korekcí RT.
• Kvantitativní výkon plánovaného Tof MRM byl stabilní a reprodukovatelný přes 300 po sobě jdoucích injekcí; automatizovaná příprava přispěla k minimalizaci variability mezi vzorky.
• Současné DIA snímání zachovalo rozsáhlé kvalitativní pokrytí — identifikace peptidů z E. coli zůstaly konzistentní (většina zpracovaných bodů v rámci ±10 % od průměru), což dokládá, že untargeted informace nejsou obětovány kvůli cílené akvizici.
• Oddělené zpracování datových proudů (MS Quan pro MRM, DIA‑NN pro MSe) umožňuje flexibilitu analýzy a kompatibilitu s existujícími proteomickými workflowy.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení počtu injekcí: jednou injekcí získáte jak potvrzení identit (qual), tak přesnou kvantifikaci (quan), což šetří čas i materiál.
• Zvýšení provozní propustnosti: standardizovaná Evosep chromatografie a automatická příprava podporují rutinní vysokopropustné nasazení.
• Zlepšení reproducibility: plánované Tof MRM a stabilní retenční časy minimalizují drift a potřebu častého rekalibrací metod při dlouhých sériích měření.
• Vhodné pro longitudinální studie a rutinní QA/QC, kde je kritická konzistence datové kvality přes stovky až tisíce injekcí.
• Možnost paralelního získání potvrzujících identifikačních dat z DIA (přesné hmotnosti a fragmentace) zvyšuje jistotu kvantifikace v komplexní matrici.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření počtu monitorovaných cílových analy­tů díky zvyšující se rychlosti TOF analyzátorů a efektivnějšímu plánování MRM rozvrhů.
• Integrace reálného času QC a prediktivní diagnostiky výkonu přístrojů pomocí strojového učení pro průběžné sledování stability metod.
• Přijetí mixed‑mode workflow v klinických, farmaceutických a environmentálních laboratořích pro kombinované screeningy a validované kvantitace biomarkerů.
• Rozšíření na jiné analytické oblasti (např. metabolomika), kde kombinace DIA + MRM může zlepšit jak objevné, tak cílené měření v jedné analýze.
• Zlepšení softwarové interoperability a automatizace zpracování pro zjednodušení validace a souladu s regulačními požadavky.

Závěr

Předložená studie prokazuje, že kombinace standardizované Evosep chromatografie, automatizované přípravy Evotipů a rychlé multi‑reflecting TOF akvizice na Xevo MRT P10 umožňuje spolehlivé a reprodukovatelné získání kvalitativních i kvantitativních dat v jediné injekci. Takový přístup zvyšuje efektivitu laboratorního provozu a je vhodný pro vysokopropustné a dlouhodobé studie, kde je klíčová stabilita a konzistence výsledků.

Reference

1. Fröhlich K.; et al. Data‑Independent Acquisition: A Milestone and Prospect in Clinical Mass Spectrometry‑Based Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 2024, 23(8), 100800.
2. Li J.; Smith L. S.; Zhu H.‑J. Data‑independent acquisition (DIA): an emerging proteomics technology for analysis of drug‑metabolizing enzymes and transporters. Drug Discovery Today: Technologies. 2021, 39, 49–56.
3. Liebler D. C.; Zimmerman L. J. Targeted quantitation of proteins by mass spectrometry. Biochemistry. 2013, 52(22), 3797–3806.
4. Mani D. R.; et al. Statistical characterization of multiple‑reaction monitoring mass spectrometry (MRM‑MS) assays for quantitative proteomics. BMC Bioinformatics. 2012, 13(Suppl 16), S9.
5. Evosep Biosystems. A standardized separation method with a throughput of 60 samples per day (Application Note AN‑008B). 2023.
6. Bache N.; et al. A Novel LC System Embeds Analytes in Pre‑formed Gradients for Rapid, Ultra‑robust Proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 2018, 17(11), 2284–2296.
7. Waters Corporation. Xevo MRT Mass Spectrometer; Xevo MRT P10 Mass Spectrometer; Andrew+ Pipetting Robot. Product documentation. 2026.