A Discovery Lipidomic Workflow Combining the Xevo™ MRT P10 with mzmine Data Processing Pipelines

Objevná lipidomická workflow kombinující Xevo MRT P10 s mzmine zpracováním dat

Význam tématu

Analýza lipidomu je klíčová pro porozumění metabolickým stavům, diagnostice nemocí a výzkumu biomarkerů, protože lipidy tvoří široce diferencované chemické třídy s významnými biologickými funkcemi. Vysoce kvalitní LC‑HRMS data s důvěryhodnou strukturální anotací jsou nezbytné pro spolehlivá srovnání vzorků, identifikaci nízkoabundantních složek a pro reprodukovatelné workflow v laboratorním provozu i výzkumu. Kombinace multi‑reflecting TOF instrumentace s pokročilým open‑source zpracováním výrazně zvyšuje hloubku a spolehlivost lipidomických profilů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat výkonnost dvou režimů získávání dat (DDA a DIA) na hmotnostním spektrometru Xevo MRT P10 při analýze lidského plazmatického standardu (NIST SRM 1950) a ukázat integrovaný pracovní postup založený na exportu dat do mzML a následném zpracování v prostředí mzmine. Studie hodnotí počet identifikací, kvalitu MS/MS fragmentací, pokrytí lipidových tříd a efektivitu zpracování dat při použití pravidlové anotace, ECN modelování, KMD analýzy a Interactive Molecular Networking spolu s QC dashboardem pro rychlou kontrolu anotací.

Použitá metodika a instrumentace

Protokol vzorkování a přípravy:

• Vzorek: organický extrakt z NIST SRM 1950 (lidské plazma).
• Extrakce: metoda Bligh a Dyer.
• Příprava: resuspendace v methanolu, technické replikáty n=3; injekční objemy 1 µL pro ESI+ a 2 µL pro ESI-.

Chromatografie:

• ACQUITY Premier UPLC s reverzní fází CSH C18 (1.7 µm, 2.1 x 100 mm).
• Rychlý RP gradient 12 minut (10 minut gradace, 1 min na vysoký organický, 1–2 min re‑equilibration).
• Mobilní fáze A: ACN:water:ammonium formate (600:390:10) + 0.1 % formic acid; mobilní fáze B: IPA:ACN:ammonium formate (900:90:10) + 0.1 % formic acid.

Mass spectrometry (Xevo MRT P10):

• Zdrojová nastavení: kapilární napětí 2.5 kV (ESI+) / 1.2 kV (ESI-); sample cone 30 V; desolvation 700 L/min při 500 °C; cone gas 20 L/min; source 120 °C.
• DDA režim: MS scan 10 Hz, MS/MS 20 Hz, top30 (ESI+) / top20 (ESI-), dynamické vyloučení 5 ppm s RT tolerancí 2 s, kvadrupólová izolační šířka 1 Da.
• DIA režim (MSE): scan rate 20 Hz (10 MS1 + 10 MS2), lineární rampa kolizních energií 25–55 eV, rozsah m/z 50–1200.

Informatika a zpracování dat:

• Automatický export dat do formátu mzML přes waters_connect Data Convert během akvizice.
• Zpracování v mzmine – kroky: detekce signálů, smoothing, filtrace izotopů, pro DIA tvorba pseudo‑MS2 spekter prostřednictvím dekonvoluce, gap‑filling a duplicate filtering, Ion Identity Networking (IIN) pro spojování aduktů a in‑source produktů.
• Anotace: pravidlová lipidová anotace s multi‑kritériovým skórováním, ECN (equivalent carbon number) modelování pro ověření retenčního chování, Kendrick Mass Defect (KMD) pro identifikaci homologních řad, Interactive Molecular Networking pro propagaci anotací mezi podobnými MS2 spektry a Lipid Annotation QC Dashboard pro vizuální kontrolu.

Hlavní výsledky a diskuse

Rozdílné výkonnosti akvizičních režimů:

• DDA: vyšší celkový počet lipidových identifikací a kratší doba zpracování dat. Nabízí cílenější vysokokvalitní MS/MS spektra, což zjednodušuje pravidlovou anotaci a snižuje potřebu rozsáhlé dekonvoluce.
• DIA: poskytuje komprehensivnější fragmentaci napříč celým m/z rozsahem a zlepšuje pokrytí některých nízkoabundantních nebo systematicky slabě selektovaných podtříd (uveden příklad: HexCer, hexosylceramidy), ale vyžaduje další kroky dekonvoluce a pseudo‑MS2 skládání.

Kvalita fragmentací a reprodukovatelnost:

• Oba režimy produkovaly vysoce reprodukovatelná MS/MS spektra vhodná pro pravidlové anotování lipidů.
• ECN modelování ukázalo konzistentní retenční chování lipidových podtříd, což pomáhá odhalit chybné přiřazení podle neočekávaných RT trendů.

Nástroje pro kontrolu kvality a propagaci anotací:

• Lipid Annotation QC Dashboard umožnil rychlé vizuální vyhodnocení vhodnosti anotací (RT distribuce, izotopové vzory, diagnostické fragmenty, duplicitní anotace).
• Interactive Molecular Networking seskupuje spektra podle podobnosti MS2, což usnadňuje identifikaci chybějících nebo neúplných anotací a umožňuje přenos důvěryhodných identifikací mezi členy sítě.

Shrnutí porovnání:

• DDA – výhodné pro rychlé a rozsáhlé identifikace s čistými MS/MS; DIA – výhodné pro systematické pokrytí a identifikaci vybraných podtříd, zejména tam, kde DDA může minout nízkoabundantní prekurzory.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy workflow:

• Integrované řešení (Xevo MRT P10 + mzmine) umožňuje transparentní, reprodukovatelné a škálovatelné zpracování lipidomických dat vhodné pro výzkum i rutinní analýzy.
• Použití pravidelné anotace, ECN a KMD významně zvyšuje jistotu identifikací a umožňuje rychlé odhalení nesrovnalostí nebo artefaktů.
• Export do mzML a open‑source zpracování podporuje interoperabilitu a dlouhodobou archivaci dat.

Možné implementace v laboratoři:

• Vyvážení DDA vs. DIA podle cíle analýzy — DDA pro maximální počet anotací a rychlé reporty, DIA pro hlubší průzkum nízkoabundantních lipidů nebo cílené třídění sphingolipidů.
• Nasazení QC dashboardu jako standardní kontrolní fáze před finálním reportingem.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje a aplikace:

• Pokračující zlepšení algoritmů pro dekonvoluci DIA spekter a integrace strojového učení pro přesnější skórování a predikci struktur.
• Rozšíření a standardizace lipidových databází a pravidel anotací, včetně lepší podpory izobarických/izomerních forem.
• Automatizace end‑to‑end workflow v cloudových prostředích a širší používání interaktivních vizualizačních nástrojů pro znalostní extrakci z velkých lipidomických studií.
• Větší důraz na harmonizaci metod mezi laboratořemi (standardy, QC procesy) pro konzistentní mezi‑laboratorní srovnatelnost.

Závěr

Studie ukazuje, že Xevo MRT P10 poskytuje kvalitní a reprodukovatelná MS/MS data v obou režimech (DDA i DIA). Kombinace s pokročilým zpracováním v mzmine (pravidlová anotace, ECN, KMD, IIN, Interactive Molecular Networking a QC dashboard) vytváří robustní a transparentní pracovní postup pro hlubokou charakterizaci lipidomu. Volba mezi DDA a DIA závisí na konkrétním analytickém cíli: DDA zrychlí a rozšíří počet identifikací, zatímco DIA doplňuje pokrytí u vybraných podtříd a nízkoabundantních složek.

Reference

1. Bligh E.G.; Dyer W.J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 1959;37(8):911–917.