Sensitive Detection of PAHs Using the Agilent 1290 Infinity III Fluorescence Detector

Význam tématu

Polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH) jsou perzistentní organické znečišťující látky s vysokou toxicitou a potenciálem bioakumulace. Kvůli karcinogenním a mutagenním vlastnostem některých PAH (např. benzo[a]pyrenu) je vyžadována vysoce citlivá a selektivní analytika v oblastech monitoringu životního prostředí, kontroly potravin a průmyslové kvality. Fluorescenční detekce po kapalinové chromatografii (HPLC/UHPLC) využívá inherentní fluorescence mnoha PAH a poskytuje v praxi výhodu nízkých detekčních limitů při minimálním rušení nefluorescenční maticí.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace bylo předvést výkonnost Agilent 1290 Infinity III Fluorescence Detector (FLD) pro kvantitativní a citlivé stanovení 16 běžných PAH. Studie se zaměřila na: optimalizaci excitačních a emisních vlnových délek pomocí online skenů, demonstraci rychlého přepínání vlnových délek během UHPLC běhu, vyhodnocení opakovatelnosti separace a určení nejnižších dosažitelných LOD/LOQ (včetně ultra-citlivého stanovení anthracenu s využitím velkého průtokového buněčného objemu).

Použitá metodika a instrumentace

• HPLC systém: Agilent 1290 Infinity III sestava – High-Speed Pump, Multisampler, Multicolumn Thermostat, Fluorescence Detector (modely G7120A, G7167B, G7116B, G7123B).
• Software: Agilent OpenLab CDS v2.8.
• Kolony: ZORBAX RRHD Eclipse Plus PAH (2.1×50 mm, 1.8 µm) a (2.1×100 mm, 1.8 µm).
• Flow cell FLD: standardní 2 µL low-dispersion cell pro UHPLC; volitelně 13 µL flow cell pro maximální citlivost.
• Doplňky: Agilent 1290 Infinity III Low Dispersion Kit pro snížení extra‑column objemu.
• Standards a rozpouštědla: standardní směs 16 PAH (500 µg/mL) v acetonitril:acetone:toluene; anthracen standard pro LOD testy; InfinityLab Acetonitrile a voda pro HPLC.
• Metoda: UHPLC gradient (v příkladu 4 minuty, průtok 0.9 mL/min, 30 °C) a delší gradienty pro kalibrace; online emisní a excitační skeny (emisní 270–800 nm při Ex 250 nm, excitační 200–380 nm při Em optimu) se 2 nm krokem pro volbu optimálních Ex/Em.
• Detekční a provozní parametry: PMT Gain Standard/High; data rate 80 Hz (možno 1.25–160 Hz); odezva 0.125 s (80 Hz); rychlost přepínání vlnových délek cca 120 ms.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizace vlnových délek: Pro každý z 16 PAH byly zjištěny individuální optimum excitační a emisní vlnové délky (online skeny). To umožnilo detekovat každou sloučeninu při jejím emisním maximu, čímž se maximalizovala citlivost a selektivita.
• Rychlé přepínání vlnových délek: FLD umožňuje přepínání vlnových délek dostatečně rychle (~120 ms) pro analýzu těsně koelujících špiček v UHPLC režimu; použitý datový tok 80 Hz poskytl dostatečný počet datových bodů na špičku pro robustní integraci.
• Chromatografický výkon: Kompletní separace 16 PAH proběhla za 4 minuty s velmi dobrou opakovatelností; retenční časy RSD obvykle <0.05% a RSD plochy <0.9% pro většinu komponent.
• Citlivost a LOD: Při použití 13 µL flow cell a PMT ve vysokém zesílení dosáhl anthracen LOD <1 fg na koloně (S/N = 3) a lineární vztah byl zachován do velmi nízkých fg úrovní (R² = 0.99971).
• Lineární dynamický rozsah (LDR): Pro většinu PAH byl dosažen LDR přes 5 dekád až více než 6 dekád. Příklad: benzo[a]pyren vykázal LDR 5.5 dekád, LOQ 19 ng/L a R² = 0.99987. LOQ hodnoty pro sadu PAH se pohybují v řádu nízkých ng/L.
• Robustnost: Nízkodisperzní hardware a kompatibilita FLD s vysokými tlaky UHPLC přispěly k nízké extracolumn variabilitě a zachování úzkých špiček.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost: Umožňuje detekce PAH v ultra‑stopových koncentracích, vhodné pro monitoring kontaminací v půdě, vodě a potravinách.
• Selektivita: Individuální Ex/Em nastavení snižuje rušení od nefluorescenčních matric a zvyšuje spolehlivost výsledků v komplexních matricích.
• Rychlost: UHPLC separace 16 PAH za 4 minuty zkracuje čas analýzy a zvyšuje propustnost laboratoře.
• Široký dynamický rozsah: Umožňuje kvantifikaci jak stopových, tak vysokých koncentrací ve stejném běhu bez nutnosti opakovaných ředění.
• Praktická flexibilita: Rychlá výměna průtokové buňky (2 µL ↔ 13 µL) a nastavení PMT umožňují přizpůsobit metodu buď pro rychlou rutinní analýzu, nebo pro maximální citlivost.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií: Kombinace FLD selektivity a selektivních MS potvrzení identity by zvýšila spolehlivost v komplexních matricích.
• Automatizované optimalizační algoritmy: Software pro automatické určení optimálních Ex/Em párov a časování přepínání by urychlil vývoj metod pro nové analyty.
• Dále snižování LOD: Pokročilé optické buňky, lepší detektory a optimalizace vzorkování mohou posunout limity detekce ještě níže pro sledování ultratrace kontaminantů.
• Rozšíření biblioték spekter: Databáze excitace/emise pro širší škálu environmentálních látek zrychlí identifikaci a vývoj metod.
• Field‑deployable UHPLC‑FLD řešení: Miniaturizované a robustní UHPLC systémy s FLD by mohly umožnit rychlé místní testování kontaminací v terénu.

Závěr

Agilent 1290 Infinity III FLD prokázal vysokou citlivost, široký lineární rozsah a dostatečnou rychlost přepínání vlnových délek pro robustní a rychlé UHPLC stanovení 16 PAH. Kombinace optimalizovaných Ex/Em parametrů, nízkodisperzního hardware a možnosti volby průtokové buňky umožňuje přizpůsobit metodu pro rutinní analýzy i pro ultra‑citlivé aplikace. Metoda je vhodná pro enviro‑monitoring, potravinářské testování a průmyslovou kontrolu kvality, kde je vyžadována vysoká citlivost a spolehlivost.

Reference

1. Agilent ZORBAX Rapid Resolution High Definition Eclipse PAH Threaded Columns. Agilent Technologies data sheet, publication number 820210-018, 2011.
2. Wiese, S.; Teutenberg, T.; Hoffmann, B.; Naegele, E. High Throughput Method Development for PAHs using the Agilent 1290 Infinity LC system and a ZORBAX Eclipse PAH column. Agilent Technologies application note, publication number 5990-5007EN, 2009.