UHPLC Method for Sensitive Automatic Analysis of Thirty-Seven D/L-Amino Acids and for Liquor Profiling

Význam tématu

Detekce a diferenciace D- a L-aminokyselin získává na důležitosti v potravinářství i v biomedicíně. D-aminokyseliny, přítomné v stopových množstvích v fermentovaných potravinách a v biologických vzorcích, ovlivňují chuť, konzervaci a aroma potravin a zároveň představují potenciální biomarkery nemocí. Kvůli nízkým koncentracím D-izoform je požadována vysoce citlivá, kvantitativní a rutinně použitelná metoda, která spolehlivě separuje D-izomery od přesycených L-izomerů bez složitého multidimenzionálního HPLC nebo nákladné LC/MS detekce.

Cíle a přehled studie

Studie představuje optimalizovanou UHPLC metodu pro současné stanovení třiceti sedmi párových D/L-aminokyselin pomocí jediné chirální derivatizační reakce. Cílem bylo dosáhnout vyšší citlivosti, kratší doby analýzy a vyšší automatizace oproti dříve popsaným postupu, které vyžadovaly dvě různé derivatizační činidla a dvojité měření každého vzorku.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda kombinuje pre-column fluorescence derivatizaci o‑ftalaldehydem (OPA) v přítomnosti N-isobutyryl-L-cysteinu (NIBC) za vzniku diastereomerů, které jsou následně separovány na UHPLC C18 sloupci s malými částicemi. Klíčovým prvkem je plně automatizované provádění mobilní fáze (blending) a pre-column derivatizace v autosampleru, čímž se minimalizuje doba mezi iniciací reakce a injekcí a zvyšuje opakovatelnost.

Použitá instrumentace:

• UHPLC systém: Nexera X3 (Shimadzu)
• Kolona: CERI L-column 3 C18, 150 mm × 2.1 mm I.D., 2.0 µm (s předfiltrací)
• Pumpy s funkcí mobilní fáze blending (nízkotlaký gradient kit)
• Autosampler s automatickou pre-column derivatizací a programovatelným protokolem
• Detektor fluorescence: RF-20AXS, Ex = 338 nm, Em = 455 nm (semimicro buňka)
• Statistické zpracování: eMSTAT Solution (multivariační analýzy, PCA)

Vybrané podmínky (shrnutí klíčových parametrů): flow 0.22 mL/min, teplota kolony 20 °C, injekční objem 1 µL; mobilní fáze: 10 mmol/L fosfátový pufr (pH 6.9) vs směs acetonitril/methanol (15:85) řízená blendingem; gradientní program zajišťuje úplnou separaci během ~66 minut.

Příprava derivatizačních činidel (shrnutí): borátový pufr (pH 9.1), OPA v ethanolu doplněné pufrem a vodou, roztok NIBC v borátovém pufru; výsledný OPA/NIBC se mísí v poměru 1:1 a používá se v autosampleru.

Hlavní výsledky a diskuse

- Separace: Všechny cílové páry (37 D/L-aminokyselin, bez prolinu) byly separovány jako OPA/NIBC diastereomery na jednom chromatografickém běhu trvajícím přibližně 66 minut. V reálných vzorcích (pivo, sake, červené a bílé víno) bylo detekováno 25–28 aminokyselin.

- Citlivost a linearita: Kalibrační křivky vykázaly v celém rozsahu vysokou linearitu s koeficienty determinace r2 ≥ 0,999 pro všechny analyty. Koncentrační rozsahy kvantifikace se lišily podle sloučeniny (např. D-izomery často kvantifikovatelné v nízkých nmol/µL úrovních).

- Reprodukovatelnost: %RSD plochy píku při šesti po sobě jdoucích analýzách standardních roztoků byly ≤1,6 % (nižší koncentrace) a ≤0,8 % (vyšší koncentrace). Hlavním faktorem pro dobrou opakovatelnost bylo udržení konstantního času mezi derivatizací a injekcí pomocí automatického protokolu.

- Aplikace na matrice: V analyzovaných lihovinách byla celková podíl D-izomerů (%D) ≤ 6 %. Pivo a vína vykázaly relativně vyšší zastoupení D-izoform oproti saké, které obsahovalo relativně více L-izoform. Některé L-aminokyseliny v reálných vzorcích přesahovaly kvantifikační rozsahy metody, což je třeba zohlednit při ředění vzorků.

- Multivariační analýza: PCA (eMSTAT Solution) rozlišila typy lihovin; PC1 reflektoval rozdíly mezi druhy nápojů, PC2 charakterizoval rozdíly poměru D/L. Zátěžové hodnoty ukázaly, které konkrétní aminokyseliny přispívají k odlišení (např. L‑Trp, D‑His, D‑Lys pro piva; D‑Val pro vína; L‑Thr pro saké).

Přínosy a praktické využití metody

• Vyšší provozní jednoduchost: jediná derivatizace (OPA/NIBC) místo dvouranného přístupu snižuje složitost a dobu analýzy.
• Automatizace: automatické mísení mobilní fáze a pre-column derivatizace v autosampleru zkracují pracovní dobu (příklad: pro 20 vzorků zkrácení z ~70 min manuální práce na ~15 min automatizované) a omezují spotřebu vialů a dalších spotřebních materiálů.
• Cenová efektivita: použití fluorescence detekce místo LC/MS snižuje investiční a provozní náklady a snižuje vliv matricových efektů na kvantifikaci.
• Univerzální aplikace: metoda je vhodná pro potravinářské vzorky, nápojový průmysl, screening ve výzkumu metabolomiky a pro studie zaměřené na biomarkery.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření spektra matric: aplikace na jiné potravinářské a biologické vzorky (např. střevní obsah, sérum) s optimalizovanou přípravou vzorků.
• Integrace s pokročilými datovými nástroji: širší použití multivariačních a strojového učení pro identifikaci biomarkerů a třídění vzorků podle původu nebo technologického zpracování.
• Další miniaturizace a vysokoprůtokové varianty pro vyšší vzorkovací kapacitu; adaptace na online nebo semi‑online přípravu vzorků.
• Komplementární použití MS: v případech potřeby vyšší selektivity nebo neznámých interferentů lze kombinovat s MS detekcí pro potvrzení identit a struktury.
• Biotechnologické a nutriční aplikace: vývoj potravin funkcionalizovaných D-aminokyselinami a využití D/L-profilu pro hodnocení kvality a bezpečnosti potravin.

Závěr

Byla vyvinuta a ověřena robustní UHPLC metoda umožňující citlivé a současné stanovení 37 D/L-aminokyselin pomocí jediné OPA/NIBC derivatizace a plně automatizované přípravy. Metoda kombinuje vysokou kvantitativní přesnost a reprodukovatelnost s praktickou proveditelností v rutinních laboratořích bez nutnosti LC/MS či složitých multidimenzionálních sestav. Demonstrace na lihovinách potvrdila schopnost metody profilovat D/L-rozložení a její vhodnost pro potravinářské a výzkumné aplikace.

Reference

1. Iwata N., Watabe Y., Horie S., Hayakawa Y., Chromatography, 42, 133–141 (2021).
2. Iwata N., Kobayashi M., Chromatography, 45, 63–72 (2024).
3. Shimadzu Application News No. L592: Automated Analysis of Thirty-seven D/L-amino Acids using Liquid Chromatography with Fluorescence Detection and Its Application to Liquor Samples.