Evaluation of a fully automated method for the measurement of glycerol in wine

Význam tématu

Glycerol je třetí nejběžnější chemickou složkou vína po vodě a ethanolu a vzniká jako vedlejší produkt alkoholové fermentace. Jeho koncentrace (obvykle kolem 5 g/L, v závislosti na podmínkách fermentace až 15–20 g/L) ovlivňuje tělo, viskozitu a vjem sladkosti vína. Spolehlivé a efektivní stanovení glycerolu je proto důležité pro výrobce vína, kontrolní laboratoře a pro zajištění konzistence produktu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo ověřit plně automatizovanou enzymatickou metodu stanovení glycerolu určenou pro Thermo Scientific Arena (a kompatibilní s Gallery a Gallery Plus) a porovnat její výsledky s výsledky analyzovanými na WineScan FT120 (FOSS) a s akreditovanou enzymatickou referenční metodou laboratoře ALKO, Inc. Studie hodnotila přesnost, opakovatelnost, lineární rozsah a srovnatelnost výsledků na reálných vzorcích vína a bílých kontrolech.

Použitá metodika

Metoda je enzymatický kolorimetrický test založený na sledování tvorby NADH při převodu glycerolu za použití glycerokinázy (GK), ADP-dependentní hexokinázy (ADP-HK) a glukóza-6-fosfát dehydrogenázy (G6P-DH). Měřením změny absorbance při 340 nm je možné kvantifikovat množství glycerolu ve vzorku.
Klíčové parametry postupu implementovaného na Arena 20XT:

• Objem vzorku: 5 µL bez předúpravy;
• První inkubace: 100 µL pufru obsahujícího D-glukózu, GK, ADP-HK a G6P-DH při 37 °C po 120 s a následné odečtení blank hodnoty;
• Následné přidání 25 µL činidla s NAD+ a ATP, inkubace 420 s a měření absorbance při 340 nm;
• End-point měření s odečtením blanku;
• Lineární rozsah metody: 0,07–30,00 g/L;
• Kalibrace: dvoubodová s dvěma replikáty.

Použitá instrumentace

• Arena 20XT discrete analyzer (Thermo Fisher Scientific) – hlavní přístroj pro photometrická měření v této studii;
• Komparativní přístroj: WineScan FT120 (FOSS) – použit pro porovnání výsledků;
• Metoda kompatibilní též s plně automatizovanými Thermo Scientific Gallery a Gallery Plus;
• Reagencie: Glycerol systémový kit (Thermo Scientific) a glycerol standard (kalibrátor); použití enzýmů GK, ADP-HK, G6P-DH, NAD+, ATP.

Materiál vzorků a kontrol

Celkem bylo analyzováno 53 vzorků vína (17 bílých, 3 rosé, 33 červených). Kontroly byly připraveny z čistého glycerolu ve vodném prostředí na dvou koncentracích. Vzorky nebyly před analýzou nijak upravovány.

Hlavní výsledky a diskuse

• Srovnání s WineScan FT120: korelační koeficient r = 0,964, což ukazuje dobrou shodu mezi metodami pro soubor testovaných vín;
• Srovnání s akreditovanou enzymatickou metodou ALKO, Inc.: korelace byla velmi vysoká (r = 1,000) na pěti proficiency test vzorcích;
• Přesnost a opakovatelnost: within-run SD u testovaných standardů a vzorků v rozmezí 4,25–10,39 g/L byla mezi 0,036 a 0,099 g/L, což indikuje vysokou přesnost při opakovaných měřeních;
• Výsledky proficiency testů: pět vzorků (různé typy vín) poskytlo hodnoty měřené na Areně těsně v tolerančních pásmech udaných pro dané vzorky – příklady: bílá vína 5,22 g/L vs tolerance 5,4 ± 0,8 g/L, červené 6,82 g/L vs 7,1 ± 1,1 g/L apod.;
• Kalibrace: dvoubodová kalibrace s dobrými regresními charakteristikami; příklady ukázaly konzistentní response kalibrátorů a nulový blank.

Diskuse: Metoda prokázala shodu s etablovanou FTIR metodou a bezchybné porovnání s akreditovanou enzymatickou referencí pro vzorky proficiency testů. Nízké hodnoty SD potvrzují dobrou opakovatelnost. Vzhledem k vodné matrici kontrol však může být užitečné ověřit vhodnost kalibrátorů pro komplexní matice některých aromatizovaných či šumivých vín. Také je třeba zohlednit, že FTIR přístroje jako WineScan měří více parametrů najednou; diskretní enzymatický test je však specifický a přesný pro glycerol a vhodný v kontrolních pracovních postupech.

Přínosy a praktické využití metody

• Plně automatizovaný provoz s velmi malým odběrem vzorku (5 µL) zvyšuje laboratorní produktivitu a snižuje spotřebu reagenů;
• Metoda nepotřebuje předběžnou úpravu vzorku, což zjednodušuje workflow;
• Dobrý rozsah měření (0,07–30 g/L) pokrývá běžné i zvýšené koncentrace glycerolu ve vínech;
• Metoda je vhodná pro rutinní kontrolu kvality, výzkumné účely i porovnávací testování s referencí;
• Možnost použití stejného přístroje pro další enzymatické testy zvyšuje flexibilitu laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace metod plně automatizovaných diskretních analyzátorů do LIMS a vyšší automatizace předanalytických kroků pro zvýšení throughputu;
• Multiplexní enzymatické sady umožňující paralelní stanovení více parametrů z jednoho vzorku s malým objemem;
• Rozvoj robustnějších matricových kalibrátorů a standardů blíže reálným vínům (šumivá, aromatizovaná vína) pro minimalizaci maticových efektů;
• Mezilaboratorní ověřování a rozšíření akreditací pro diskretní enzymatické metody v oenologii;
• Využití pokročilých datových nástrojů a AI pro korekce maticových efektů a predikci výsledků z kombinace metrik (FTIR + enzymatické měření).

Závěr

Test Thermo Scientific Glycerol použitý na Arena 20XT ukázal vysokou přesnost, vynikající opakovatelnost a dobrou shodu s výsledky získanými na WineScan FT120 i s akreditovanou enzymatickou metodou ALKO, Inc. Metoda poskytuje praktické výhody v podobě plné automatizace, minimálního odběru vzorku a širokého měřicího rozsahu, což ji činí vhodnou pro rutinní oenologickou analýzu glycerolu. Doporučuje se zvážit zavedení vhodných matricových kalibrátorů a pokračovat v mezilaboratorních ověřeních pro zajištění přenositelnosti výsledků.

Reference

1. Ribéreau-Gayon P., Glories Y., Maujean A., Dubourdieu D. Handbook of Enology, Volume 2: The Chemistry of Wine Stabilization and Treatments. John Wiley & Sons, New York, 2000.
2. O’Kennedy K. Glycerol: The Myth. newworldwinemaker.com, 2010. [online zdroj]
3. Patterson T. Many Roads to Mouthfeel. winesandvines.com, [online zdroj].
4. Organisation Internationale de la Vigne et du Vin (OIV). Compendium of International Methods of Wine and Must Analysis, 2009.