A Simple Method for Determination ofβ-Sitosterol as a Marker of Vegetable Oil Adulteration in Ghee by GC

Význam tématu

Clarifikované máslo (ghee) je v Indii i dalších regionech vysoce ceněný potravinářský produkt. Vysoká cena vede k riziku úmyslného ředění nebo falšování rostlinnými oleji. β-sitosterol, běžný rostlinný sterol, slouží jako spolehlivý marker přítomnosti rostlinných tuků v mléčném tuku. Rychlé, reprodukovatelné a nákladově efektivní analytické metody pro kvantifikaci β-sitosterolu jsou klíčové pro kontrolu kvality, regulaci trhu a prevenci podvodů ve výrobě potravin.

Cíle studie

Cílem bylo vyvinout jednoduchou, citlivou a rutinně použitelnou metodu pro extrakci a stanovení β-sitosterolu z ghee pomocí plynové chromatografie s plamenně ionizační detekcí (GC-FID) a ověřit její použitelnost pro detekci adulterace ghee rostlinným olejem dle navrhované metody FSSAI No. 01.097:2022.

Použitá metodika

Byla použita saponifikační extrakce a následné GC-FID měření. Klíčové kroky přípravy vzorků a standardů:

• Příprava standardu: 10 mg β-sitosterolu v 10 mL – zásobní roztok 1000 mg/kg (rozpouštědlo chloroform). Kalibrační řada: 1, 2, 5, 10, 20, 50 a 100 mg/kg v hexanu.
• Vzorky ghee: 1 g vzorku bylo saponifikováno 25 mL 5% methanolu KOH, refluxováno při 95 °C po dobu 45 minut.
• Extrahování: po ochlazení třikrát extrahováno n‑hexanem (3 × 15 mL), sloučené extrakty sušeny nad bezvodým Na2SO4, promyty vodou, odpařeny pod proudem N2 a rekonstituovány v 0,5 mL n‑hexanu.
• Filtrace konečného roztoku přes 0,45 µm filtr a injekce 0,5 µL do GC-FID.
• Pro ověření metody byly provedeny opakovatelnosti, recovery studie a analýza záměrně adulterovaných vzorků (2 %, 5 %, 10 % rostlinného oleje).

Použitá instrumentace

• Plynový chromatograf: Shimadzu Nexis GC-2030 s FID detektorem.
• Autosampler: AOC-20i+s Plus (zmíněn v hlavičce aplikace).
• Kolona: SH-I-Rxi-5Sil MS, 30 m × 0,25 mm i.d., df = 0,25 µm (P/N: 221-75954-30).
• Podmínky GC: vstřikování v režimu split (15:1), objem 0,5 µL; injektor 320 °C; nosný plyn dusík, průtok kolony 0,7 mL/min; program pece 140 °C (2,0 min) rampou 15 °C/min do 320 °C (celkem 16 min); FID 320 °C; plyny pro FID: vzduch 200 mL/min, H2 32 mL/min, N2 24 mL/min.

Hlavní výsledky a diskuse

• Linearity: Multibodová kalibrace v rozsahu 1–100 mg/kg vykázala dobrou lineární závislost s R2 ≈ 0,99.
• Citlivost: Metoda dokázala detekovat adulteraci ghee rostlinným olejem již při 2 % podílu. Pro 2 % adulteraci byl naměřen signál β-sitosterolu odpovídající ~4 mg/kg; u 5 % a 10 % byly naměřeny přibližně 11 mg/kg a 22 mg/kg.
• Limit detekce: Prohlášeno jako ekvivalent 2 % adulterace (S/N > 3).
• Opakovatelnost a přesnost: Pro opakované injekce standardů při 10 mg/kg byla relativní odchylka pro retenční čas ~0,05 % RSD a pro plochu ~1,72 % RSD. Metoda při pěti replikách vykázala %RSD <0,1 % pro retenční čas a <5 % pro plochu (uvedené obecné limity pro opakovatelnost).
• Recovery: Při přídavcích 20 mg/kg a 50 mg/kg byly navrácené hodnoty 91 % a 98 %, což indikuje uspokojivou účinnost extrakce a minimální ztráty během zpracování.
• Blank kontrola: Neadulterované (čisté) vzorky ghee nevykazovaly signál v retenčním čase β-sitosterolu, což potvrzuje selektivitu metody vůči markeru rostlinného původu.

Přínosy a praktické využití metody

• Metoda je jednoduchá, rychlá a nákladově efektivní, vhodná pro rutinní kontroly v potravinářských laboratořích a při hospodářské kontrole kvality ghee.
• Vysoká reprodukovatelnost, dostatečná citlivost (detekce 2 % adulterace) a dobré recovery zajišťují spolehlivou detekci i menších podílů rostlinného tuku.
• Metoda je v souladu s navrhovanými postupy FSSAI a může být použita při interních kontrolách výrobců i při regulačních inspekcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metody o kybernetické knihovny a hromadné stanovení více sterolů by umožnilo podrobnější profilování zdrojů tuků a zlepšilo identifikaci specifických druhů rostlinných olejů.
• Integrace s GC–MS by zvýšila selektivitu a umožnila potvrzení identity β-sitosterolu v komplexních matricích, což je výhodné u vzorků s nízkými hladinami nebo interferencemi.
• Automatizace přípravy vzorků (robotické extrakce, SPE) by zvýšila průchodnost a reprodukovatelnost v komerčních laboratořích.
• Rozvoj rychlých screeningových metod (např. rychlá GC nebo kapilární elektroforéza) by mohl sloužit jako předběžný test před kvantifikací GC-FID/GC-MS.

Závěr

Vyvinutá GC-FID metoda na přístroji Shimadzu Nexis GC-2030 poskytuje spolehlivé kvantitativní stanovení β-sitosterolu v ghee, umožňující detekci adulterace rostlinnými oleji při hladinách již od 2 %. Metoda kombinuje jednoduchou přípravu vzorku, dobré analytické parametry (linearita, opakovatelnost, recovery) a proveditelnost v běžné laboratorní praxi, takže je vhodná pro rutinní kontrolu kvality a ověřování pravosti mléčného tuku.

Reference

1. Kala A., et al. Determination of triacyl glycerol and sterol components of fat to authenticate milk fat based sweets. Journal of Food Science and Technology. 2016;53. doi:10.1007/s13197-016-2182-3.
2. Food Safety and Standards Authority of India. Method for detection of adulteration in milk fat (clarified milk fat) with vegetable oils. File No. 1-90/FSSAI/SP (MS&A)/2009 dated 25 March 2018. (Navrhovaná metoda FSSAI No. 01.097:2022).