Quantification of HIV Antiretroviral Drugs in Human Plasma by Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation Time-of-Flight Mass Spectrometry

Význam tématu

Analytika terapeutických hladin antiretrovirotik je klíčová pro farmakokinetické studie, monitorování adherence a bezpečnosti léčby HIV. Tradičně se k tomu využívají LC–MS/MS metody, které však vyžadují časově náročnou chromatografii. Ukázková studie demonstruje použití MALDI-TOF MS jako rychlé, citlivé a méně pracné alternativy pro kvantifikaci proteázových inhibitorů v lidské plazmě, což může významně zvýšit průchodnost vzorků v preklinickém i klinickém kontextu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo prokázat proof-of-principle kvantitativního stanovení lopinaviru (LPV) v lidské plazmě pomocí benchtop MALDI-8030 EasyCare a ověřit, že metoda může splňovat kritéria podle FDA pro bioanalytickou validaci. Jako interní standard (I.S.) byl použit ritonavir (RTV) a autor/ky zkoumali linearitu, opakovatelnost a přesnost v rámci stanoveného rozsahu koncentrací včetně stanovení LLOQ.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Vzorek: 10 µL lidské plazmy odstavené od zdravého dárce, do kterých byly přidány standardy LPV a konstantní množství RTV I.S. (finální koncentrace RTV = 500 nM).
• Proteinová precipitace: přidáno 70 µL methanolu k dosažení finálního objemu 100 µL (1/10 ředění), extrakce 1 h při 4 °C, následné centrifugování 5 min při 15 000 rpm (přibližně 21 130 rcf).
• Příprava pro MALDI: supernatant smíchán 1:1 s matrixem CHCA (5 mg/mL v 50:50 acetonitril/voda) obsahujícím 50 mM NaTFA jako cationizační činidlo; 1 µL premixu nanesen na MALDI terč.
• Kalibrace a QC: sedm kalibrátorů LPV (1 500; 1 000; 750; 500; 250; 100; 75 nM), QCs: vysoký 1,2 µM, střední 600 nM, nízký 225 nM (≤3× LLOQ). LLOQ stanoveno na 75 nM.

Instrumentace:

• MALDI-8030 EasyCare (Shimadzu) – benchtop MALDI-TOF MS, pozitivní ionový režim.
• Detekce: analyty pozorovány převážně jako sodiované ionty [M + Na]+ (LPV m/z ≈ 651.35, RTV m/z ≈ 743.30).
• Nastavení akvizice: rozsah m/z ~100–1 000, 100 snímků na profil při 200 Hz; u dat byla aplikována lock-mass korekce pomocí vypočtené hodnoty RTV pro lepší hmotnostní přesnost.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla velmi dobré linearity: koeficient determinace R2 = 0,9987 pro kalibrační křivku založenou na poměru výšek píků LPV/RTV (průměr z 5 replikací na koncentraci). LLOQ byl potvrzen jako 75 nM. Procentní variabilita (CV%) a přesnost (% bias) všech kalibrátorů a QC splňovaly kritéria FDA pro bioanalytickou validaci (CV ≤ 15 % a bias ≤ ±15 %, s výjimkou LLOQ, kde limity jsou CV ≤ 20 % a bias ≤ ±20 %).

Simulovaný „blind“ vzorek o nominální koncentraci 400 nM byl stanoven jako 372 nM metodou MALDI-TOF (relativní odchylka přibližně −7 %), což je v rámci akceptovatelných tolerance podle použitých kritérií. Data ukazují, že heterogenita MALDI nanesení, typicky problematická pro kvantifikaci, byla efektivně kompenzována použitím interního standardu. Bloky bez doplněných látek neukázaly interferenci v oblasti signálů LPV a RTV.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorku a vysoká propustnost: jednoduchá precipitace proteinů a přímé nanesení umožňuje zkrácení doby na analýzu oproti LC–MS/MS.
• Možnost vyřadit chromatografii: eliminace separačního kroku snižuje čas, potřebu rozpouštědel a komplexnost provozu, což je výhodné pro screeningové a farmakokinetické studie s vysokým počtem vzorků.
• Splnění regulačních požadavků: metoda byla vyvíjena a validována podle FDA doporučení, což podporuje její použitelnost v preklinickém a výzkumném prostředí.

Omezení a poznámky k interpretaci

• MALDI kvantifikace je silně závislá na vhodném interním standardu; ideálně by se používaly stabilně izotopově značené analoga pro ještě lepší korekci matričních efektů.
• Metoda byla demonstrována jako proof-of-principle na vybraném proteázovém inhibitoru a pro užší regulační použití bude nutné ověření na větším počtu primárních vzorků a mezi-laboratorní srovnání.
• Potenciální interferenty v klinických vzorcích (lékové metabolity, konkomitantní léčba, lipémie apod.) vyžadují další testování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kvantitativního MALDI-TOF na další malé molekuly a terapeutika s použitím izotopově značených interních standardů pro zlepšení přesnosti.
• Automatizace nanášení matrixu a robotizovaný spotting ke snížení variability mezi body na terči a ke zvýšení reprodukovatelnosti.
• Integrace s rychlými separačními technikami nebo tzv. ambientními ionizačními přístupy pro snížení matričních efektů tam, kde je to potřeba.
• Možné nasazení v klinických laboratořích pro terapeutické monitorování léků (TDM) a vysokopropustné PK studie v prostředí, kde je prioritou rychlost a nízké provozní náklady.

Závěr

Studie prokázala, že MALDI-TOF MS na přístroji MALDI-8030 EasyCare může poskytnout kvantitativní výsledky pro lopinavir v lidské plazmě s lineárním rozsahem zahrnujícím LLOQ 75 nM a vynikajícími parametry přesnosti a precize dle FDA kritérií při využití ritonaviru jako interního standardu. Metoda nabízí atraktivní alternativu k LC–MS/MS pro aplikace vyžadující vysokou propustnost a zjednodušenou přípravu vzorků, avšak vyžaduje pečlivé validace pro širší klinické nasazení.

Reference

1. van Kampen JJA, Reedijk ML, Burgers PC, Dekker LJM, Hartwig NG, et al. Ultra-Fast Analysis of Plasma and Intracellular Levels of HIV Protease Inhibitors in Children: A Clinical Application of MALDI Mass Spectrometry. PLoS ONE. 2010;5(7):e11409.
2. Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. U.S. Food and Drug Administration. 2018.