Evaluation of Mass Accuracy Robustness for the Agilent InfinityLab Pro iQ Plus

Hodnocení robustnosti a přesnosti hmotnosti pro Agilent InfinityLab Pro iQ Plus — shrnutí aplikace

Význam tématu

Detekce a spolehlivá identifikace nízkomolekulárních látek (např. drog v toxikologii) je v praxi kritická pro rychlou šaržovou analýzu. Jednodušší, jednopaprskové (unit‑resolution) přístroje založené na kvadrupólu jsou v laboratorní praxi preferovány pro jejich nízké provozní náklady a robustnost. Problémem však bývá omezená přesnost m/z (typicky řád desetin Da), která komplikuje jistotu identifikace; postakviziční kalibrace spektra proto představuje atraktivní cestu ke zvýšení výpovědní hodnoty dat bez nutnosti přechodu na dražší vysokorozlišovací MS. Tato studie hodnotí, nakolik je Agilent InfinityLab Pro iQ Plus stabilní při dlouhodobém opakování analýz a jak velké zlepšení přesnosti hmotnosti lze dosáhnout softwarovou kalibrací (Cerno MassWorks).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo prověřit robustnost signálu a stabilitu přesnosti hmotnosti Agilent Pro iQ Plus při >1 150 po sobě jdoucích injekcích směsi toxikologických standardů bez čištění či opětovného ladění. Dále bylo cílem ocenit efekt postakviziční kalibrace pomocí Cerno MassWorks (TrueCal) na redukci chyby m/z a tím zvýšit kvalitu identifikace analyzovaných sloučenin.

Použitá metodika a instrumentace

Souhrn metodiky:

- Vzorky: Agilent LC/MS toxicology checkout mix, připravené jako dva koncentr. standardy 100 pg/µL a 10 pg/µL v 60:40 H2O:MeOH.
- Mobilní fáze: A — voda s 2 mM amonným formiátem a 0,1 % formiovou kyselinou; B — methanol s 0,1 % formiovou kyselinou.
- Režim: krátký gradient s celkovou dobou běhu ~6 min + 1,5 min postrun; objem injekce 1 µL; průtok 0,5 mL/min; teplota kolony 60 °C.

Použitá instrumentace (samostatná sekce dle požadavku):

- HPLC: Agilent 1260 Infinity II LC Clinical Edition (multisampler, multicolumn thermostat, binary pump).
- Kolona: Agilent ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18, 2.1 × 50 mm, 1.8 µm.
- MS: Agilent InfinityLab Pro iQ Plus jednopaprskový (single quadrupole) detektor.
- Ionizace: Agilent Jet Stream (AJS) v pozitivitním režimu.
- Softwarové zpracování: Agilent OpenLab CDS a MassHunter Quantitative Analysis; postakviziční korekce hmotnosti: Cerno Bioscience MassWorks (verze uvedená v originále).

Kalibrace MassWorks:

- Použity referenční ionty z ESI‑L tune mixu (m/z 118.0863, 322.1527, 622.0290, 922.0098).
- Postchromatografická infuze ladicího roztoku byla prováděna po eluci vysokokoncentrovaného standardu (1 injection každých 50 nízkokoncentrací). Celkem bylo během studie použito 23 kalibračních injekcí pro aplikaci TrueCal korekcí.

Hlavní výsledky a diskuse

- Po chromatografickém optimalizačním kroku byla směs devíti analyzátů separována ve ~6 min. Dva izomery (phentermine/methamphetamine) nebylo možné rozlišit pouze podle m/z, takže byly uvažovány jako jeden analytický signál.
- Robustnost signálu: během >1 150 injekcí nízké koncentrace (10 pg/µL), s periodickými injekcemi 100 pg/µL, vykazovaly plochy píků nízkou variabilitu. Pro jednotlivé komponenty byly zjištěny %RSD v rozmezí přibližně 4–7 %, tedy pod 10 % (v souladu s abstraktem). Po 50 po sobě jdoucích injekcích zůstalo osm z devíti komponent v rozmezí ±20 % od průměru, což naznačuje stabilitu signálu; menší pokles signálu byl připisován postupnému opotřebení kolony.
- Stabilita a přesnost referenčních iontů před korekcí: calibrantní ionty m/z 622 a 922 měly průměrné rozdíly Δ mDa ~14.6 a 16.2 mDa (23–26 ppm) s %RSD ~9–11 %, bez nárůstu chyb v průběhu serií injekcí — tedy konzistentní výkon přístroje.
- Efekt MassWorks korekce: aplikovaná postakviziční kalibrace významně snížila odchylku měřených hmotností. Například u diazepamu byla průměrná chyba snížena z ~42.3 mDa (raw) na ~8.39 mDa po korekci (přibližně pětinásobné zlepšení). Pro ostatní analyty přinesla korekce průměrné chyby v řádu jednotek až desítek mDa (průměrně pod 25 mDa), tedy několikrádové zlepšení oproti neupraveným datům.

Přínosy a praktické využití metody

- Demonstrace stability: Pro iQ Plus dokázal udržet stabilní signál a konzistentní měření během velmi rozsáhlé série injekcí bez zásahů, což je klíčové pro vysokoprůtokové toxikologické laboratoře.
- Nákladově efektivní zvýšení spolehlivosti identifikace: Použití softwarové postakviziční kalibrace (MassWorks) umožňuje výrazné zlepšení přesnosti m/z u unit‑resolution kvadrupólu, čímž se zvyšuje jistota při tentativní identifikaci látek bez nutnosti přechodu na HRMS.
- Implementace do pracovních postupů: Metodu lze aplikovat v rutinních kontrolních protokolech — pravidelné infuze ladicího roztoku a periodická aplikace korekcí poskytují kontinuální sledování a kompenzaci drobných posunů v čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Širší integrace postakvizičních korekcí: Očekává se rostoucí využití softwarových nástrojů k opravě systémových posunů i u dalších typů unit‑resolution přístrojů.
- Kombinace s on‑line infuzí (lock‑mass) v reálném čase: i když MassWorks funguje postakvizičně, vývoj směruje k hybridním strategiím (on‑line lock mass + postprocessing) pro okamžité a dlouhodobě konzistentní měření.
- Zlepšení chromatografických podmínek a výměna spotřebního materiálu: další optimalizace může zvýšit konzistenci signálu mezi dlouhými běhy, zejména u krátkých rychlých metod.
- Rozšíření o vzorky z reálné matrice: přenos protokolu z testovací směsi na biologické vzorky (moč, krev, sliny) a ověření vlivu matice na účinnost korekcí.

Závěr

Studie ukazuje, že Agilent InfinityLab Pro iQ Plus poskytuje vysokou robustnost pro sériové toxikologické analýzy a že softwarová kalibrace MassWorks výrazně zlepšuje přesnost hmotnosti u jednopaprskového kvadrupólu. Kombinace stabilního LC/MS pracoviště a postakviziční korekce umožňuje zvýšit spolehlivost identifikací za nižší náklady než nasazení HRMS, což je výhodné pro rutinní a vysoce propustné toxikologické laboratoře.

Reference

• Tan J.; Rylski A.; Bergqvist A.; Stephanson N. Automated and Fully Validated High-Throughput LC-MS/MS Assay for Analyzing Multiple Drugs of Abuse in Oral Fluids. J. Mass Spectrom. 2025, 60(5), e5132.
• Gibbons B. C.; Chambers M. C.; Monroe M. E.; Tabb D. L.; Payne S. H. Correcting Systematic Bias and Instrument Measurement Drift with mzRefinery. Bioinformatics 2015, 31(23), 3838–3840.
• Olsen J. V.; de Godoy L. M. F.; Li G.; Macek B.; Mortensen P.; Pesch R.; Makarov A.; Lange O.; Horning S.; Mann M. Parts per Million Mass Accuracy on an Orbitrap via Lock Mass Injection. Mol. Cell. Proteomics 2005, 4(12), 2010–2021.
• Abel R. J. Identification of Unknown Compounds from Quadrupole GC-MS Data Using Cerno Bioscience MassWorks. Can. Soc. Forensic Sci. J. 2014, 47(2), 74–98.
• Wang Y.; Gu M. The Concept of Spectral Accuracy for MS. Anal. Chem. 2010, 82(17), 7055–7062.