Analysis of Tris(Hydroxymethyl)Aminomethane in Oligonucleotide Active Pharmaceutical Ingredient (API) Using Ion Chromatography

Význam tématu

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) je běžně používaná pufrační složka ve výrobě oligonukleotidů a jiných biotechnologických produktů. Pro finální léčivé přípravky je obvyklé, aby byl Tris odsraněn nebo minimalizován, protože je považován za nežádoucí nečistotu. Spolehlivé stanovení reziduálního Trisu v přítomnosti běžných anorganických kationtů (Li+, Na+, NH4+, K+, Mg2+, Ca2+) je proto důležité pro QA/QC laboratoře, které se zabývají výrobou a kontrolou oligonukleotidových API. Ionová chromatografie (IC) umožňuje selektivní separaci těchto složek; článek popisuje úpravu eluentu pomocí krunových sloučenin a organického modifieru pro současnou analýzu Trisu a minerálních kationtů bez potlačení (non-suppressor IC).

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo vyvinout a demonstrovat analytickou metodu založenou na non-suppressor ionové chromatografii pro současné stanovení Trisu a šesti běžných kationtů v roztocích oligonukleotidového API. Studie ukazuje, jak přidání dvou krunových (crown) sloučenin do eluentu umožňuje separaci Trisu od sodíku a jak přidání acetonitrilu zkracuje doby elučního průběhu. Metoda byla ověřena na směsných standardech a aplikována na reálný vzorek oligonukleotidového API v režimu spike & recovery.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda: non-suppressor ionová chromatografie se selektivním ovlivněním retence pomocí krunových sloučenin (18-crown-6 a 15-crown-5). Detekce prováděna vodivostním detektorem.

Systém a kolony (uvedeno ve studii):

• Analyzační systém: HIC-NS (non-suppressor ion chromatograph).
• Kolona: Shim-pack IC-C4, 150 mm × 4.6 mm I.D., 7 µm; ochranná kolona Shim-pack IC-C4(G), 10 mm × 4.6 mm I.D., 7 µm.

Podmínky elučního systému (příklad):

• Eluent bez organického modifieru: 2.5 mmol/L methansulfonové kyseliny obsahující 5 mmol/L 18-crown-6 a 5 mmol/L 15-crown-5.
• Eluent s organickým modifierem (zrychlení): výchozí eluent smíchaný s acetonitrilem v poměru 95:5 (v článku tento zásah zkracuje doby elučního průběhu a umožňuje eluci Ca2+ do 20 min).
• Tok: 1.0 mL/min, teplota kolony: 40 °C, injekční objem: 50 µL, detekce: vodivost.

Příprava eluentu: příkladně připraveno smícháním 1.25 mL 2 mmol/L methansulfonové kyseliny s 1.322 g 18-crown-6 a 992 µL 15-crown-5 do 1 L ultrapure vody.

Hlavní výsledky a diskuse

Separační schopnost:

• Přidání 18-crown-6 je obvyklé pro kontrolu retence kationtů; samotných 5 mmol/L 18-crown-6 nepostačuje pro separaci Trisu od Na+. Kombinace 5 mmol/L 18-crown-6 a 5 mmol/L 15-crown-5 umožnila oddělení Trisu od sodíku tím, že selektivně prodloužila retenci Na+ bez významného prodloužení celkové analýzy pro ostatní kationty.
• Přidání 5 % acetonitrilu do eluentu (analytické podmínky 2) výrazně zkrátilo časy elučních píků (např. Ca2+ byl elutován do 20 minut), aniž by byla narušena separace Tris/Na.

Linearity a opakovatelnost:

• Byly připraveny směsné standardy v rozsahu od 0.02 do 0.4 mg/L pro Li až po 0.5–10 mg/L pro Tris v několika úrovních (STD1–STD5).
• Korelační koeficienty (r2) pro všechny analyty > 0.999 (vysoká lineárnost).
• Opakovatelnost ploch píků při šesti opakovaných injekcích (STD3) vykázala nízké %RSD: typicky 0.35–2.12 % pro jednotlivé kationty a 0.52 % pro Tris, což potvrzuje dobrou přesnost metody.

Aplikace na API a spike & recovery:

• Vzorek oligonukleotidového API rozpuštěn v ultrapure vodě (600 mg/L) obsahoval ~30 mg/L Na+; Tris v původním vzorku nebyl detekován.
• Po přídavku Trisu na 3 mg/L (odpovídá 0.5 % hmotnosti API) byla provedena spike & recovery zkouška s výsledkem 94.3 % návratnosti Trisu, což indikuje správnost metody v matici API.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje:

• Souběžné kvantitativní stanovení Trisu a šesti běžných kationtů v jedné analýze, čímž se snižuje počet měření a spotřeba vzorku.
• Spolehlivé rozlišení Trisu a sodíku pomocí kombinace dvou krunových sloučenin bez potřeby výrazného prodloužení doby analýzy.
• Rychlejší analýzy při jednoduchém přidání acetonitrilu do eluentu, což zvyšuje laboratorní propustnost.

Praktické využití: kvantifikace reziduálního Trisu v kontrolách kvality oligonukleotidových API, monitorování čisticích kroků výroby, a souběžná analýza anorganických kontaminantů v bioprocesních roztocích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možnosti dalšího rozvoje a nasazení metody zahrnují:

• Validace metody podle farmaceutických norem (LOQ/LOD, specifita, stabilita, přesnost, meziměrná opakovatelnost) a její začlenění do QA protokolů pro oligonukleotidové léčiva.
• Optimalizace poměrů a typů krunových sloučenin pro jiné kombinace kationtů nebo pro zlepšení selektivity v komplikovanějších matricích.
• Přechod na hyphenované přístupy (IC–MS) pro vyšší selektivitu a nižší limity detekce, zejména pokud je nutné dosahovat stopových hladin Trisu.
• Automatizace přípravy elučního systému a online ředění vzorků pro vyšší reproducibilitu a throughput.
• Rozšíření metodiky na jiné organické aminy a pufry používané ve výrobě biologik.

Závěr

Popsaná non-suppressor ion chromatografická metoda s použitím 18-crown-6 a 15-crown-5 umožňuje spolehlivou a lineární simultánní analýzu Trisu a šesti běžných kationtů v kontextu oligonukleotidových API. Přidání drobného množství organického rozpouštědla (acetonitrilu) účinně zkracuje dobu analýzy. Metoda prokázala dobrou opakovatelnost a návratnost ve spikovaných vzorcích, což ji činí vhodnou pro zavedení do QC laboratorních postupů po standardní validační sadě testů.

Reference

1. Mizuki Hayakawa. Analysis of Tris(Hydroxymethyl)Aminomethane in Oligonucleotide Active Pharmaceutical Ingredient (API) Using Ion Chromatography. Shimadzu Application News, First Edition March 2026.
2. Application News No. 01-00274-JP. Příklad pozitivního využití non-suppressor ion chromatograph (příbuzná aplikace uvedená autorem).
3. Juzen Chemical Co., Ltd. – poskytnuté vzorky a spolupráce při vývoji aplikace (uvedeno v poděkování článku).