Autofluorescence Subtraction with the Agilent NovoCyte Opteon Spectral Flow Cytometer

Autofluorescence a její odečtení pomocí Agilent NovoCyte Opteon

Význam tématu

Autofluorescence buněk vzniká díky endogenním molekulám (aromatické aminokyseliny, lipofusciny, pyridinové nukleotidy, flaviny) a může výrazně zhoršit rozlišení signálu v průtokové cytometrii. V konvenčním přístupu může být vysoká autofluorescence zdrojem falešně pozitivních signálů nebo snížené citlivosti. Spektrální průtoková cytometrie umožňuje zachytit kompletní emisní spektrum a tím separovat fluorochromní signál od autofluorescence, což vede k přesnějšímu kvantifikování markerů a lepší identifikaci subpopulací buněk. Tento přístup je klíčový při práci s biologickými vzorky s variabilní nebo intenzivní autofluorescencí (např. některé tkáně, stabilizovaná krev, plíce myší).

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat, jak charakterizace a vyjmutí autofluorescenčního spektra zlepšuje přesnost „unmixingu“ (rozpletání spektrálních signálů) a rozlišení fluorochromů u různých typů vzorků. Autoři porovnávali výsledky s a bez zahrnutí autofluorescenčních spekter při analýze čerstvé a stabilizované lidské krve, myších slezin a plic. Studie také popisuje strategie identifikace jedinečných autofluorescenčních populací pomocí softwaru NovoExpress a ukazuje, kdy stačí jednoduchý přístup a kdy je nutný složitější postup.

Použitá instrumentace

• Agilent NovoCyte Opteon spektrální průtokový cytometr se 5 lasery (349, 405, 488, 561, 637 nm) a až 70–73 detektory pro široké spektrální pokrytí.
• Softwarové nástroje: Agilent NovoExpress pro identifikaci autofluorescenčních populací, výpočet spekter a kontrolu podobnosti spekter (similarity matrix).
• Standardní laboratorní vybavení a reagencie: lytické a fixační roztoky (např. AceaLyse, PFA), RBC lysis buffer, enzymová trávení (kolagenáza, DNáza) pro plicní tkáně, blokátory Fc receptorů, živé/úmrtné barvení (PI, Live/Dead), pufry (PBS, HBSS) a FBS.
• Antitělové panely byly sestaveny pro konkrétní typy vzorků (imunofenotypizace lidské krve, myší sleziny a plic) s typickými kombinacemi fluorochromů používaných v studie.

Použitá metodika

Analytický postup zahrnoval přípravu vzorků (lyze erytrocytů, enzymatická digesce plic, filtrace, značení protilátkami, fixace), zaznamenání spektrálních dat unstained kontrol a single-stain vzorků a následný spektrální unmixing s nebo bez zahrnutí autofluorescenčních spekter. Identifikace AF spekter byla prováděna na základě spektrálních hustotních plotů a hierarchického gatin­gu; odlišnost spekter byla kvantifikována pomocí similarity matrix (práh distinctness ≤ 0,95). V případě heterogenní autofluorescence byly v unmixingu zahrnuty více než jedno AF spektrum, zatímco u homogenních vzorků stačilo spektrum jediné populaci.

Hlavní výsledky a diskuse

• Různorodost autofluorescenčních podpisů: Stabilizovaná lidská krev vykazovala silnější a relativně homogenní AF signál oproti čerstvé krvi, kde byl signál nízký a dopad na unmixing byl minimální.
• Myší slezina: Ze spektrálních dat byly identifikovány dvě jasně odlišné AF populace (označené AF-A1 a AF-B). Zahrnutí obou spekter do unmixingu odstranilo falešně pozitivní „šumy“ a zlepšilo identifikaci buněčných subsetů.
• Myší plíce: Vzorek s vysokou a heterogenní autofluorescencí vyžadoval identifikaci čtyř samostatných AF spekter. Bez jejich začlenění vznikaly rozsáhlé artefakty a falešné populace; zahrnutí AF spekter odstranilo tyto artefakty a umožnilo správné imunofenotypování (11 rozpoznaných populací zahrnujících makrofágy, neutrofily, epiteliální buňky apod.).
• Problematika single-stain spekter: Heterogenní autofluorescence může zkreslit výpočet referenčního spektra (rozdíl pozitivní vs. negativní), pokud tyto podsoubory mají odlišnou AF intenzitu. Řešení zahrnuje vyhledání negativních a pozitivních populací s homogenní AF v rámci vybraného gate (např. kanály s výrazným AF), nebo použití kompenzačních/bead kontrol v obtížných případech.

Přínosy a praktické využití metody

• Zlepšení rozlišení fluorochromů a snížení falešně pozitivních signálů v komplexních nebo vysoce autofluorescenčních vzorcích.
• Umožnění spolehlivého imunofenotypování tkáňových buněk (např. plicní buňky, slezinové populace), kde tradiční filtrační přístupy selhávají.
• Flexibilita: jednoduché přidání jediného AF spektra postačuje pro homogenní vzorky; pro heterogenní vzorky lze adaptivně přidat více spekter po vyhodnocení similarity matrix.
• Praktické doporučení pro laboratoře: vždy měřit unstained kontroly, ověřit homogenitu AF, používat similarity threshold a preferovat gating na kanálech s výrazným AF pro volbu jednolité referenční populace.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Automatizace identifikace AF spekter s pomocí strojového učení pro rychlé rozpoznání a filtrování redundantních spekter.
• Integrace robustnějších algoritmů unmixingu, které lépe zvládnou heterogenní AF bez potřeby rozsáhlého ručního gatin­gu.
• Širší použití spektrální cytometrie v klinických a preklinických studiích, zejména tam, kde tkáňová autofluorescence dříve limitovala citlivost analýzy.
• Vývoj standardizovaných panelů AF kontrol (včetně beadových sad) pro validaci spektrálních panelů a zjednodušení převodu protokolů mezi laboratořemi.

Závěr

Spektrální přístup a systematické odečtení autofluorescence pomocí Agilent NovoCyte Opteon a softwaru NovoExpress výrazně zlepšují kvalitu dat u vzorků s různou mírou a heterogenitou AF. Volba strategie (jedno vs. více AF spekter, gating, použití beadů) by měla vycházet z předběžné analýzy unstained vzorků. Při dodržení doporučených postupů lze minimalizovat artefakty, zvýšit přesnost unmixingu a rozšířit použitelnost průtokové cytometrie pro náročné biologické vzorky.

Reference

1. Monici M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnol Annu Rev. 2005;11:227-256. DOI: 10.1016/S1387-2656(05)11007-2.
2. Ferrer-Font L, Small SJ, Lewer B, Pilkington KR, Johnston LK, Park LM, Lannigan J, Jaimes MC, Price KM. Panel optimization for high-dimensional immunophenotyping assay using full-spectrum flow cytometry. Curr Protoc. 2021;1(9):e222. DOI: 10.1002/cpz1.222.
3. Mitchell AJ, Pradel LC, Chasson L, Van Rooijen N, Grau GE, Hunt NH, Chimini G. Technical advance: autofluorescence as a tool for myeloid cell analysis. J Leukoc Biol. 2010;88(3):597-603. DOI: 10.1189/jlb.0310184.
4. Lokwani R, Chaudhari R, Wolf MT, Sadtler K. Spectral cytometry on highly autofluorescent samples. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:71. DOI: 10.1038/s43586-022-00156-0.
5. Roet JEG, Mikula AM, de Kok M, et al. Unbiased method for spectral analysis of cells with great diversity of autofluorescence spectra. Cytometry A. 2024;105(8):595-606. DOI: 10.1002/cyto.a.24856.