Rapid postmortem analysis of novel psychoactive substances using a high-resolution Orbitrap mass spectrometry method

Význam tématu

Postmortem toxikologické testování hraje klíčovou roli při určování příčin úmrtí souvisejících s užíváním nelegálních drog a při včasném varování veřejného zdraví před vznikajícími riziky. Náhlý nárůst úmrtí v důsledku opioidů a nových psychoaktivních látek (NPS) vyžaduje citlivé, rychlé a přizpůsobitelné analytické postupy. Vysoce rozlišená LC–HRAM (liquid chromatography–high resolution accurate mass) hmotnostní spektrometrie umožňuje rutinní kvantitativní screening i následnou retrospektivní analýzu dat pro identifikaci dosud nezahrnutých či nově objevených sloučenin.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout spolehlivou, rychlou a průběžně použitelnou kvantitativní LC–HRAM metodu pro postmortem krevní analýzy, která zároveň umožní retrospektivní hledání nových psychoaktivních látek. Studie popisuje implementaci metody v B.C. Provincial Toxicology Centre (PTC) pomocí Vanquish Flex UHPLC a Q Exactive HF Orbitrap, nasazení rutinního 12,5minutového screenu a následnou re‑analýzu dat pro detekci např. bromazolamu v postmortem vzorcích.

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorky: postmortem krev z případů podezření na toxikaci (2020–2021 pro retrospektivní analýzu bromazolamu; širší soubor 2020–2022 pro trendy NPS).
• Extrakce: salt‑assisted liquid–liquid extraction s ledově chladným methyl tert‑butyl ether/acetonitrilem (1:9 v/v). Po odpaření byl extrakt rekonstituován v methanolu:ultračisté vodě (1:1) a injektováno 2 μL.
• Chromatografie: Thermo Scientific Accucore Phenyl‑Hexyl kolona (2.1 × 100 mm) v gradientním režimu; mobilní fáze A: 2 mM amonná formiátová s 0,1 % formiovou kyselinou ve vodě; B: 2 mM amonná formiátová s 0,1 % formiovou kyselinou v acetonitril:methanol (1:1). Průtok 0,5 mL/min, doba běhu 12,5 min; teploty kolony/autosampler 40 °C/10 °C.
• Hmotnostní spektrometrie: Thermo Scientific Q Exactive HF hybridní kvadrupól‑Orbitrap v pozitivním ESI režimu; full scan se zacíleným data‑dependent MS2 na inkluzivní seznam >200 látek. Klíčové provozní parametry: přibližné hodnoty plynových proudů a napětí uvedené v laboratorním protokolu (např. spray voltage ~3000 V, capillary ~380 °C).
• Software a zpracování dat: Thermo Scientific TraceFinder 4.0 s interní NPS databází vytvořenou in‑house (chemický vzorec, přesné hmotnosti prekurzorů a produkt‑iontů). Retrospektivní re‑interrogace datových souborů umožnila detekci sloučenin mimo původní rutinní panel.
• Kvantifikace: standard addition (kalibrace přímo v matrici vyšetřovaného případu). Validace zahrnovala linearitu (r2 > 0,99), LOD ~0,1 ng/mL, LOQ 0,5 ng/mL, recovery, matrix effects, carryover a testy interferencí s běžnými léky a drogami.

Hlavní výsledky a diskuse

• Bromazolam: v retrospektivní analýze případů z roku 2021 bylo nalezeno 41 pozitivních případů, z toho 27 mělo koncentrace nad LOQ (0,5 ng/mL). Průměrná koncentrace nad LOQ byla 11,4 ± 53,7 ng/mL, medián 1,6 ng/mL, rozsah 0,5–319,3 ng/mL. Sedm případů mělo koncentrace mezi LOD a LOQ; u sedmi případů chyběl dostatek materiálu pro kvantitaci.
• Ko‑detekce: ve všech případech bromazolamu byly přítomny další látky (celkem 47 různých látek/metabolitů v 41 případech). Nejčastěji se projevoval fentanyl (88 % případů) a jeho metabolit norfentanyl; stimulancia (methamphetamine/amphetamine) se vyskytla ve více než polovině případů.
• Trend NPS (2020–2022): z celkem 2 865 záchytů představovaly benzodiazepiny ~54 % a fentanylové analogy ~9,7 %. Etizolam a flualprazolam dominovaly v roce 2021; bromazolam se poprvé objevil v lednu 2021 a do konce roku 2022 se stal nejčastěji detekovaným benzodiazepinem v provincii. Nitazenové sloučeniny byly zjištěny vzácně.
• Operativní přínos: zavedení rychlého 12,5min per‑run screenu zvýšilo průchodnost laboratoře a umožnilo zaslat předběžné výsledky koronérovi do 24 hodin. Současně umožnila vysoká datová kvalita retrospektivní identifikaci dříve nezahrnutých NPS.
• Omezení: postmortem matrix a variabilita vzorků ovlivňují interpretaci koncentrací; některé případy postrádaly dostatek materiálu pro potvrzení/kvantifikaci; retrospektivní identifikace je závislá na dostupnosti referenčních dat (product ions, přesné hmotnosti) a na inkluzivnosti databází.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý, citlivý a kvantitativní screening vhodný pro rutinní postmortem laboratoře s vysokým průtokem případů.
• Retrospektivní analýza HRAM dat poskytuje možnost zpětné identifikace NPS bez nutnosti opětovného měření vzorků, což zlepšuje sledování nově vznikajících hrozeb ve street‑supply.
• Standard addition umožňuje přesnější kvantifikaci v komplexním postmortem matrixu, minimalizuje vliv matrix efektů a zvyšuje spolehlivost výsledků pro soudní a veřejnozdravotní účely.
• Integrace výsledků do rychlého reportingu zlepšuje reakční dobu pro coronery a veřejné zdravotnické intervence (harm‑reduction, upozornění na obzvlášť toxické šarže).

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření ne‑cílených (untargeted) HRMS přístupů a zdokonalení retrospektivních algoritmů pro rychlejší detekci neznámých analogů.
• Vytváření a sdílení rozsáhlých, aktualizovaných databází NPS (mz, fragmenty, retenční časy) mezi laboratořemi pro rychlejší identifikaci novinek.
• Automatizace zpracování dat a použití strojového učení pro priorizaci signálů s vysokým rizikem toxicit.
• Vývoj validovaných referenčních materiálů a interních standardů pro stále se měnící spektrum NPS, včetně kvantitativních standardů pro emergentní látky jako bromazolam.
• Posílení multidisciplinární spolupráce mezi forenzními laboratořemi, veřejným zdravím a analytickými výrobci pro rychlejší zpětnou vazbu a adaptaci rutin.

Závěr

Nasazená LC–HRAM metoda s Q Exactive HF a Vanquish Flex představuje efektivní nástroj pro rychlý kvantitativní screening postmortem krve a současně poskytuje cenný datový archiv pro retrospektivní identifikaci nových psychoaktivních látek. Konkrétně identifikace a kvantifikace bromazolamu v řadě případů ilustruje schopnost metody odhalit změny v ilegálním trhu s drogami a přispět k včasným zásahům veřejného zdraví. Pokračující rozvoj databází, standardizačních materiálů a analytických nástrojů podpoří rychlejší a spolehlivější detekci budoucích NPS.

Reference

1. United Nations Office on Drugs and Crime. Early Warning Advisory on New Psychoactive Substances. (Přístup 10. 8. 2023).
2. Mérette S.A.M.; Thériault S.; Piramide L.E.C.; Davis M.D.; Shapiro A.M. Bromazolam Blood Concentrations in Postmortem Cases—A British Columbia Perspective. Journal of Analytical Toxicology 2023, 47(4), 385–392. doi:10.1093/jat/bkad005.
3. Skinnider M.A.; Mérette S.A.M.; Pasin D.; Rogalski J.; Foster L.J.; Scheuermeyer F.; Shapiro A.M. Identification of Emerging Novel Psychoactive Substances by Retrospective Analysis of Population‑Scale Mass Spectrometry Data Sets. Analytical Chemistry 2023, 95(47), 17300–17310.
4. UBC Media. New Process for Screening Old Urine Samples Reveals Previously Undetected Designer Drugs. Nov 2023. (Zpráva o médiích).