Fast protein analysis of mucins using an AZURA® SEC System

Význam tématu

Muciny jsou klíčové glykoproteiny zabezpečující ochranu a hydrataci sliznic. Analýza jejich molekulové hmotnosti a distribuce je nezbytná pro pochopení biologických funkcí a pro přípravu čistých frakcí využitelných v diagnostice biomarkerů a v biomedicínském výzkumu.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo ověřit výkon systému KNAUER AZURA® SEC ve spojení s kolonou AppliChrom® VivoSep SEC 350 pro rychlou a vysoce rozlišenou analýzu komerčně dostupných bovinních submaxilárních a vepřových žaludečních mucinů.

Použitá metodika a instrumentace

• Technika: velikostní výlučná chromatografie (SEC) při neutrálním pH a pokojové teplotě.
• Kolona: AppliChrom® VivoSep SEC 350 (modifikovaný polymer, rozsah 2 500–1 000 000 Da).
• Příprava vzorku: přímé použití komerčních vzorků mucinů.
• Parametry separace:
  • Tok: 1 ml/min, izokratický režim voda/PBS.
  • Injekce: 8 µl, režim částečná smyčka.
  • Teplota kolony: 25 °C, celkový čas analýzy 20 min.
  • Detekce: DAD při 220 nm a RID, datová četnost 10 Hz, časová konstanta 0,1 s.

Použitá instrumentace

• Pumpa AZURA® P 6.1L LPG s hlavou APH30EA
• Autosampler AZURA® AS 6.1L (862 bar)
• Detektor DAD 2.1L (190–700 nm)
• Detektor RID 2.1L
• Thermostat AZURA® CT 2.1
• Eluentní miska AZURA® E 2.1L
• Kolona AppliChrom® VivoSep SEC 350, 10 µm, 300 × 8 mm
• Software ClarityChrom® 9.1.0 včetně SEC/GPC modulu

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza obou typů mucinů byla dokončena do 15 min, což významně zkracuje dobu oproti tradičním kolonám (až 300 min). VivoSep sloupce prokázaly vysokou tlakovou stabilitu (50–200 bar), umožňující použití menších částic (7–10 µm) a dosažení lepšího rozlišení molekulových hmot.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá analýza distribuce molekulových hmot mucinů.
• Šetrné podmínky zachovávají nativní konformaci a biologickou aktivitu.
• Izolace čistých mucinových frakcí pro další analytické a diagnostické aplikace.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření modifikovaných SEC kolon pro analýzu komplexních glykoproteinů a jejich integrace s multi-detekčními systémy. Další zkracování doby analýzy při zachování vysoké selektivity a přesnosti.

Závěr

Spojení systému KNAUER AZURA® SEC a AppliChrom® VivoSep SEC kolon poskytuje efektivní, rychlou a vysoce rozlišenou metodu pro analýzu mucinů, šetří čas a zachovává jejich biologickou funkci.

Reference

1. Jumel K., Fiebrig I., Harding S.E. Rapid size distribution and purity analysis of gastric mucus glycoproteins by SEC-MALS. Int J Biol Macromol. 1996;18(1-2):133–139.
2. Schoemig V., Isik E., Martin L., Berensmeier S. Solid–liquid extraction of porcine gastric mucins. RSC Adv. 2017;7(63):39708–39717.
3. Johansson M.E.V., Larsson J.M.H., Hansson G.C. The two mucus layers of colon organized by MUC2 mucin. PNAS. 2010;108(Suppl 1):4659–4665.
4. Crouzier T. et al. Modulating mucin hydration and lubrication by deglycosylation and PEG binding. Adv Mater Interfaces. 2015;2(18).
5. Schömig V.J. et al. Optimized purification of porcine gastric mucin. RSC Adv. 2016;6(50):44932–44943.
6. Schuster-Little N. et al. Immunoaffinity-free chromatographic purification of CA125. Anal Methods. 2024;16(37):6337–6348.
7. Felder M. et al. MUC16 (CA125): tumor biomarker to therapy. Mol Cancer. 2014;13(1).
8. Hall M. Size Exclusion Chromatography. Biopharmaceutical Process. 2018:421–432.
9. Hostettmann K., Marston A. Separation of Macromolecules. Preparative Chromatography Techniques. 1998:202–216.
10. Sandberg T., Blom H., Caldwell K.D. Potential use of mucins as biomaterial coatings. J Biomed Mater Res A. 2008;91A(3):762–772.