Characterization of four saturated fatty acids using gradient HPLC-CAD highlighting optimized evaporation temperature control features

Význam tématu

Analýza mastných kyselin kontaminujících polysorbáty je zásadní pro zajištění kvality farmaceutických a biotechnologických produktů. Polysorbáty se využívají jako emulgátory a solubilizátory při formulaci bílkovin, kde zabraňují jejich agregaci a degradaci. Přítomnost volných mastných kyselin může způsobit tvorbu nerozpustných částic, což ohrožuje účinnost a bezpečnost přípravku.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo ověřit vliv vylepšené kontroly teploty odpařovací trubice (EvapT) a detekčního modulu (CDM) u nového modelu Vanquish Charged Aerosol Detector P series na analýzu čtyř běžných nasycených mastných kyselin (lauric, myristic, palmitic, stearic acid). Studie se zaměřila na optimalizaci EvapT pro dosažení co nejvyššího poměru signál-šum a na efekt zapnutí Temperature Coupling Mode na citlivost, zejména u semi-volatile látek.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci mastných kyselin byl použit gradientní RP-UHPLC na systému Vanquish Flex Quaternary UHPLC se sloupcem Hypersil GOLD C18 (50 x 2,1 mm, 1,9 µm). Detekce byla prováděna Charged Aerosol Detektorem HP. Mobilní fáze obsahovala 0,05 % kyseliny mravenčí ve vodě a v acetonitrilu. Teplota kolony činila 25 °C, injekční objem 10 µL. Pro data bylo použito Chromeleon CDS 7.3.2.
Seznam klíčového vybavení:

• Vanquish Flex Quaternary UHPLC system
• Vanquish Charged Aerosol Detector HP
• Hypersil GOLD C18 kolona
• Chromeleon Chromatography Data System

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo zjištěno, že šum signálu se při změně EvapT mezi 25 a 40 °C příliš nemění, avšak poměr signál-šum u mastných kyselin klesá s rostoucí teplotou. Optimální EvapT pro všechny čtyři analyty je 25 °C. Zapnutí Temperature Coupling Mode, kdy je teplota detekčního modulu nastavena o +5 °C vůči EvapT, vedlo ke zlepšení citlivosti, zejména pro nejlabilnější lauric acid (+46,8 % S/N). U méně těkavých kyselin (palmitic, stearic) byl nárůst nižší (20,3 % a 9,4 %). Robustnost metody byla ověřena 24hodinovým sledováním – RSD poměru signál-šum zůstal pod 10 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Jednoduchou a přímou detekci mastných kyselin bez nutnosti derivatizace
• Vysokou citlivost a široký lineární rozsah díky CAD
• Robustní výkon pro QC v surovinách i konečných formulacích
• Možnost optimalizace teplotních parametrů EvapT a CDM pro různé typy analyzovaných látek

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj může směřovat k:

• Automatizovaným protokolům pro rychlé nastavení teplotních režimů podle volatility cílových sloučenin
• Integraci s dalšími detektory pro komplexní profilaci neiontových surfaktantů
• Rozšíření aplikace na analýzu dalších semi-volatile kontaminantů ve farmaceutických formulacích
• Využití pokročilých softwarových nástrojů pro predikci optimálních nastavení CAD

Závěr

Optimalizace teploty EvapT na 25 °C spolu se zapnutím Temperature Coupling Mode přinesla významné zlepšení citlivosti CAD pro analýzu čtyř nasycených mastných kyselin. Metoda je robustní, snadno implementovatelná v rutině QC a poskytuje spolehlivou detekci i u semi-volatile sloučenin.

Reference

• 1. Shi L, Shen G, Chai R, Gamache PH, Jin Y. A review of polysorbate quantification and its degradation analysis by liquid chromatography coupled with charged aerosol detection. Journal of Chromatography A. 2025;1742:465651.
• 2. Siska CC, Pierini CJ, Lau HR, Latypov RF, Fesinmeyer RM, Litowski JR. Free fatty acid particles in protein formulations, Part 2: Contribution of polysorbate raw material. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2015;104:447–456.
• 3. Doshi N, Giddings J, Luis L, et al. Comprehensive assessment of all-oleate polysorbate 80: Free fatty acid particle formation, interfacial protection and oxidative degradation. Pharmaceutical Research. 2021;38:531–548.
• 4. Schilling K, Pawellek R, Lovejoy K, Muellner T, Holzgrabe U. Influence of charged aerosol detector instrument settings on the ultra-high-performance liquid chromatography analysis of fatty acids in polysorbate 80. Journal of Chromatography A. 2018;1576:58–66.