Characterization of polysorbate 80 in (bio)pharmaceuticals using HPLC-CAD

Význam tématu

Polysorbát 80 (PS80) je v biotechnologických a farmaceutických přípravcích klíčovým nekaciontovým surfaktantem pro stabilizaci proteinových látek. Jeho složení tvoří stovky molekul s různým stupněm esterifikace, které ovlivňují kvalitu, stabilitu i bezpečnost konečného produktu. Spolehlivá charakterizace PS80 je proto nezbytná pro vývoj, kontrolu kvality a sledování stability (bio)farmaceutických formulací.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na dvě hlavní oblasti:

• Ověřit použití diverteru v Charged Aerosol Detectoru (CAD) pro odstranění nechtěných matricových složek (histidin, sacharóza) a tím zvýšit robustnost a automatizaci analýzy.
• Využít konceptu „power value“ (PV) pro lineární kalibraci signálu CAD v optimálním koncentračním rozsahu a zvolit ideální PV hodnotu pro kvantitativní stanovení PS80.

Použitá instrumentace

• Vanquish™ Flex Inverse Gradient LC systém:
  – Základní modul Horizon/Flex (P/N VF-S01-A-02)
  – Dual Pump F (P/N VF-P32-A-01)
  – Split Sampler FT (P/N VF-A10-A-02)
  – Column Compartment H (P/N VH-C10-A-03)
  – Charged Aerosol Detector HP (P/N VH-D21-A-01)
  – Workflow Kit pro Inverse Gradient (P/N 6036.2010)
• Chromatografická kolona Accucore™ C18 150 × 2,1 mm; 2,6 µm (P/N 17126-152130)
• Chromeleon™ CDS 7.3.2 pro akvizici a vyhodnocení dat
• Pomůcky pro přípravu vzorku:
  – Fisherbrand™ Mini Vortexer
  – Orion 3 Star™ pH metr
  – SureSTART™ ampule, šroubovací vialy, pipety Finpipette™ F1

Použitá metodika

Vzorek PS80 byl ve vodném roztoku (1 mg/mL) připraven společně s histidinem (4 mg/mL) a sacharózou (55 mg/mL). Mobilní fáze A tvořil 5 mM roztok amonného formiátu, pH 4,8, mobilní fáze B byla 50/50 (v/v) isopropanol/acetonitril. Analýza probíhala vylučovacími podmínkami inverzního gradientu (flow 0,4 mL/min, 50 °C, injekce 10 µL). CAD byl nastaven s diverterem na odklon neudržovaných píků (0–1,3 min do odpadu) a s simultánním sběrem čtyř kanálů s PV 1,5; 1,8; 2,25; 2,4. Kalibrace byla provedena od 0,5 mg/mL do 2,5 mg/mL v trojím opakování.

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy ukázaly čtyři skupiny píků PS80 podle stupně esterifikace (volné POE, mono-, di- a tri-/tetraesterifikované složky). Použití diverteru eliminovalo rané matrice (histidin, sacharóza) a zlepšilo RSD plochy skupiny 1 zhruba 3×. Analýza PV hodnot odhalila, že PV 1,8 poskytuje nejnižší střední relativní odchylku (< 4 %) a vysoké R2 (0,9997), což umožnilo lineární kalibraci signálu CAD v daném rozsahu. Z celkové plochy píků byla čistota PS80 ve formulaci stanovena na 96,2 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a robustní charakterizace PS80 v přítomnosti matrice.
• Eliminace kontaminace detektoru a automatizace integrace píků díky diverteru.
• Přesná kvantifikace skupinového profilu PS80 s optimalizovanou lineární kalibrací signálu CAD.
• Užitečné pro QC laboratoře, vývoj formulací a sledování stability surfaktantu v biopreparátech.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metoda lze rozšířit o analýzu kompletních proteinových formulací, sledování degradačních drah (oxidace, hydrolýza) a automatizaci celého workflow. Kombinace s hmotnostní detekcí či online mapování reaktorových podmínek může prohloubit porozumění chování surfaktantů v reálných bioprocesních aplikacích.

Závěr

Inverse gradientní HPLC-CAD metoda s diverterem a nastavením PV 1,8 poskytuje spolehlivou skupinovou charakterizaci polysorbátu 80 v (bio)farmaceutických formulacích. Zavedení divertoru zvýšilo robustnost a rychlost analýzy, optimalizovaná kalibrace zajistila kvalitní kvantifikaci a metoda je připravena pro rutinní QC i výzkumné aplikace.

Reference

• Thermo Fisher Scientific Application Note 73979: Polysorbate-80 profiling by HPLC with charged aerosol and mass detection, 2021.
• De Pra M. et al., Degradation of polysorbate investigated by a high-performance liquid chromatography multi-detector system, J. Chromatogr. A 2023, 1710, 464405.
• Carnes K.A. et al., A platform analytical method for intact polysorbates in protein-containing biopharmaceutical products via HPLC-CAD, J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2022, 45(17–20):259–270.
• Thermo Fisher Scientific Technical Note 73299: Charged Aerosol Detection – Use of the power function and robust calibration practices, 2019.