Integrated Transcriptomics and Metabolomics Study of Retinoblastoma Using Agilent Microarrays and LC/MS/GC/MS Platforms

Význam tématu

Aplikace integrované transkriptomiky a metabolomiky poskytuje komplexní pohled na molekulární mechanismy onemocnění. V případě retinoblastomu, vzácného dětského nádoru sítnice, umožňuje odhalit změny genové exprese a metabolických drah, které by samostatné metody nemusely identifikovat. Tato strategie přispívá k objevu nových biomarkerů a cílů pro terapii.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo zmapovat rozdíly v expresi mRNA, miRNA a metabolitů mezi retinoblastomovými a kontrolními vzorky tkáně a očních tekutin. Využitím Agilent SurePrint G3 mikroarrayů pro transkriptomiku a GC/Q-TOF a Q-TOF LC/MS platforem pro metabolomiku autoři identifikovali klíčové biochemické dráhy spojené s progresí nemoci.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky pocházely z devíti čerstvě zmražených retinoblastomových tkání a dvou kontrol. Celková RNA byla extrahována Agilent Absolutely RNA miRNA kitem a kvalita ověřena pomocí TapeStation. mRNA a miRNA značení a hybridizace proběhly na Agilent SurePrint G3 GE a miRNA mikroarrayeru se skenováním na SureScan. Metabolity z aqueous a vitreózní humoru a slz se extrahovaly monophasickou směsí methanol–ethanol (1:1), poté se analyzovaly:

• LC/MS: Agilent 1290 Infinity LC, 6550 iFunnel Q-TOF, C18 a HILIC kolony, pozitivní i negativní režimy
• GC/MS: Agilent 7890C GC, 7200 GC/Q-TOF, DB-5ms kolona, derivatizace podle Fiehn standardů

Data zpracovávala softwarová řešení Agilent MassHunter Qualitative, Profinder, GeneSpring GX 13.1 a Mass Profiler Professional s vyhledáváním v METLIN databázi.

Hlavní výsledky a diskuse

Transcriptomika odhalila přibližně 1 600 diferencovaně exprimovaných genů (P ≤ 0,05, FC ≥ 10). Mezi nejvýznamnější patřily dráhy phototransdukce a retinol metabolismu. Analýza miRNA identifikovala 18 signifikantních miRNA, jejichž cílové geny se shodovaly s diferencovanou mRNA.
Metabolomika pomocí GC/MS odhalila desítky diferencovaných metabolit (karbohydráty, aminokyseliny), zatímco LC/MS potvrdila přes 1 300 anotovaných sloučenin. Integrací dat multi-omics byl potvrzen význam biosyntézy rozvětvených aminokyselin: u retinoblastomu byla snížená exprese enzymu BCAT1 vedoucí k akumulaci valinu. Dále byla narušena purinová metabolická dráha s nižšími hladinami inozinu a kyseliny močové v slzách pacientů s Rb.

Přínosy a praktické využití metody

Integrovaný postup nabízí možnost současného monitorování genových a metabolických změn v jednom experimentálním souboru. Takové přístupy lze využít k:

• identifikaci biomarkerů pro včasnou diagnostiku a prognózu retinoblastomu
• určení nových terapeutických cílů v rámci narušených drah
• optimalizaci personalizované léčby na základě molekulárního profilu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj multi-omics povede k zahrnutí proteomiky a lipidomiky pro ještě hlubší pochopení patogeneze. Důležitá je také aplikace single-cell technologií pro mapování heterogenity nádorových buněk. Využití pokročilých bioinformatických nástrojů a strojového učení umožní prediktivní modely pro klinickou praxi.

Závěr

Studie dokázala, že spojení Agilent transkriptomických a metabolomických platforem umožňuje odhalit dosud nepoznané biologické aspekty retinoblastomu. Objevené dráhy biosyntézy rozvětvených aminokyselin a purinové metabolismu otevírají cestu k dalšímu výzkumu a potenciálním biomarkerům.

Reference

1. Dweep H., et al. miRWalk: prediction of possible miRNA binding sites by walking the genes of three genomes. Journal of Biomedical Informatics, 2011, 44(5):839–847.
2. Palazoglu M., Fiehn O. Metabolite Identification in Blood Plasma Using GC/MS and the Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library. Agilent Technologies Application Note 5990-3638EN, 2009.