Highly Sensitive Targeted Method for Single Cell Lipidomics on Stellar MS – A Hybrid Nominal Mass Instrument

Význam tématu

Lipidomics na úrovni jedné buňky přináší zásadní vhled do heterogenity buněčných populací. Tradiční analýza na úrovni celkových vzorků vyhlazuje rozdíly mezi jednotlivými buňkami a neumožňuje odhalit vzácné buňky či subpopulace s odlišným lipidovým profilem. Aplikace citlivých metod pro jednocelkovou lipidomiku je proto klíčová pro pochopení vývojových procesů, buněčné diferenciace, patofyziologie nádorů nebo metabolismu v různých typech buněk.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a ověřit vysoce citlivou a cílenou metodu pro jednocelkovou lipidomiku za pomoci hmotnostního spektrometru Stellar MS. Autoři sledovali zvýšení specifity, citlivosti a propustnosti analýzy lipidu v buňkách linie RK13 a Vero. Pro komplexní charakterizaci lipidů bylo dosaženo kombinace bezcílového sběru dat (DDA) na Orbitrap Ascend Tribrid MS a cílené analýzy na nominálním hmotnostním přístroji Stellar MS.

Použitá metodika a instrumentace

• Extrahce lipidů z hromadných vzorků a z jednotlivých buněk RK13 a Vero pomocí standardních protokolů.
• Separace lipidů pomocí UHPLC systému Vanquish Neo s kolonkou EASY‐Spray PepMap Neo C18 (75 µm × 150 mm, 2 µm).
• Untargeted DDA analýza na Orbitrap Ascend Tribrid MS k vytvoření seznamu kandidátních lipidů.
• Cílená nanoLC‐MS analýza na Stellar MS s využitím nominální hmotnostní detekce a multi‐stupňové fragmentace (MSn).
• Zpracování dat v softwaru Thermo Scientific Compound Discoverer 3.4, LipidSearch 5.2 a Skyline pro anotaci, kvantifikaci a validaci lipidových signatur.

Hlavní výsledky a diskuse

• Na základě dat z hromadné extrakce byl sestaven cílený seznam 864 lipidů s vysokou jistotou anotace.
• V jednocelkových extraktech bylo identifikováno 258 lipidů, přičemž se prokázaly výrazné rozdíly mezi buňkami RK13 a Vero.
• PCA analýza kvantitativních dat ukázala jasné oddělení dvou typů buněk podle lipidového profilu.
• Využití MSn fragmentace pomohlo rozlišit koelutující izomery a zvýšit důvěryhodnost anotací.

Přínosy a praktické využití metody

Tato cílená metoda umožňuje cenově dostupnější a rychlejší analýzu lipidů na úrovni jediné buňky bez nutnosti vysoce vybaveného Orbitrap zařízení. Zvýšená citlivost a specifičnost přináší přesné kvantifikace i vzácných lipidů, což je zásadní pro klinické a translační studie. Metodu lze aplikovat v onkologii, neurobiologii, vývoji nových léčiv nebo při sledování buněčného metabolismu v reálném čase.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj nano‐UHPLC technik pro zvýšení propustnosti, integrace AI‐řízených nástrojů pro automatizovanou anotaci lipidů a rozšíření metod pro multiplexní analýzu proteinů a metabolit v jedné buňce. Kombinace single cell lipidomics s prostorovou metabolomikou otevře nové možnosti mapování biochemických drah v rámci tkání a orgánů.

Závěr

Studie úspěšně demonstrovala, že kombinace cílené nanoLC‐MS analýzy na Stellar MS a bezcílového sběru dat na Orbitrap Ascend přináší vysoce citlivou, spolehlivou a efektivní platformu pro jednovou buňkovou lipidomiku. Přístup umožňuje odhalit buněčnou heterogenitu a poskytuje hodnotné poznatky pro biomedicínský výzkum.