GC/MS detection of short chain fatty acids from mammalian feces using automated sample preparation in aqueous solution

Význam tématu

Profil krátkých mastných kyselin (SCFA) v exkrementech savců odráží aktivitu střevní mikrobioty a má klíčový význam pro výzkum trávení, metabolických onemocnění a modulaci imunity. SCFA jsou vysoce volatilní a hydrofilní, což ztěžuje jejich přímou analýzu; optimalizované přípravné postupy a derivatizace jsou proto nezbytné pro spolehlivou detekci pomocí GC/MS.

Cíle a přehled studie

Cílem studie je představit rychlý, automatizovaný postup pro profilování a kvantifikaci SCFA C1–C7 ve vzorcích živočišných exkrementů. Klíčové body:

• Derivatizace isobutylchloroformátem/isobutanolem v aqueous roztoku bez sušení vzorků
• Optimalizace separace, identifikace a kvantifikace více než sedmi SCFA pomocí GC/MS

Použitá metodika

Vzorky (100–150 mg) byly homogenizovány v 10% isobutanol–vodném roztoku s keramickými kuličkami, následovalo odmaštění fázovým rozdělením (NaOH, chloroform) a separace vodné fáze. Derivatizace probíhala přidáním 50 µl isobutylchloroformátu, odplyněním, uzavřením reakční zkumavky a extrakcí 150 µl hexanu. Analýza derivátů se uskutečnila na GC/MS v režimu scan m/z 30–350.

Použitá instrumentace

• Agilent 7890B GC s 5977B MSD
• Agilent 7693A autosampler
• Kolonka VF-5ms (30 m × 0,25 mm, 0,5 µm)
• Precellys Evolution pro homogenizaci

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožnila spolehlivou separaci a kvantifikaci 14 SCFA (C1–C7) s vynikající linearitou (R² ≥ 0,996). Derivatizační činidlo bylo plně odděleno od raně eluovaných kyselin (formové, octové), takže nedocházelo k interferencím. V testovaných vzorcích dominovaly kyselina octová, propionová a máselná.

Přínosy a praktické využití metody

• Plně automatizovaný protokol vhodný pro rutinní vysoce průtočnou analýzu
• Bez nutnosti sušení vzorků, minimalizace ztrát a variability
• Užitečné pro studium mikrobiálních fermentačních procesů, diagnostiku gastrointestinálních onemocnění a vývoj terapeutik

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření o izotopově značené interní standardy pro zlepšení kvantifikace v komplexních matricích. Integrace s dalšími metabolomickými přístupy (LC/MS, NMR) přinese komplexnější profilování metabolitů a hlubší pochopení interakcí mezi hostitelem a mikrobiotou.

Závěr

Navržený protokol nabízí rychlý, robustní a reprodukovatelný postup pro analýzu SCFA ve vzorcích živočišných exkrementů. Díky minimalizaci kroků a možnosti automatizace je vhodný pro rutinní i výzkumné aplikace v oblasti metabolomiky a mikrobiálního výzkumu.

Reference

1. Matsumoto, M.; et al. Impact of intestinal microbiota on intestinal luminal metabolome. Scientific Reports 2012, 2(233), 1–10.
2. Primec, M.; Mičetić-Turk, D.; Langerholc, T. Analysis of short-chain fatty acids in human feces: A scoping review. Analytical Biochemistry 2017, 526, 9–21.
3. Olsen, M. A.; Mathiesen, S. D. Production rates of volatile fatty acids in the minke whale (Balaenoptera acutorostrata) forestomach. British Journal of Nutrition 1996, 75, 21–31.
4. Pons, A.; et al. Sequential GC/MS Analysis of Sialic Acids, Monosaccharides, and Amino Acids of Glycoproteins on a Single Sample as Heptafluorobutyrate Derivatives. Biochemistry 2003, 42, 8342–8353.
5. Hallmann, C.; van Aarssen, B. G. K.; Grice, K. Relative efficiency of free fatty acid butyl esterification. Choice of catalyst and derivatization procedure. Journal of Chromatography A 2008, 1198–1199, 14–20.
6. Zheng, X.; et al. A targeted metabolomic protocol for short-chain fatty acids and branched-chain amino acids. Metabolomics 2013, 9(4), 818–827.