Optimizing LC-MS/MS settings for plasma proteomics analysis with cap-flow LC separation and dia-PASEF

Význam tématu

Proteomická analýza krevní plazmy nabízí cenné informace o zdravotním stavu a biomarkerech, avšak je náročná kvůli širokému dynamickému rozsahu proteinů a požadavku na vysokou propustnost analýz v klinickém výzkumu. Optimalizace kapilární průtokové chromatografie (cap-flow LC) spojené s moderní dia-PASEF hmotnostní spektrometrií umožňuje rychlé a reprodukovatelné zpracování stovek vzorků denně, což je klíčové pro projekty s velkými kohortami.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na nastavení a optimalizaci LC-MS/MS protokolu pro analýzu plazmatických vzorků s vysokou propustností (120–220 vzorků/den). Hlavní cíle byly:

• Vyvinout rychlé gradienty (6–10 minut) pro cap-flow LC separaci.
• Optimalizovat dia-PASEF akvizici pro úzké chromatografické píky.
• Zhodnotit výkon při analýze neat plazmy a plazmy obohacené o nízkomolekulární proteiny (ENRICH-iST).
• Porovnat jednou a dvakrát odstředěné vzorky pro konzistentní identifikaci proteinů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a detekci byly využity:

• HPLC systém Waters M-Class s vlastním ovladačem v HyStar.
• Kapilární kolona Bruker-Max (C18, 10 cm × 150 µm, 1,5 µm) při 60 °C.
• Ionizační zdroj a timsTOF HT spektrometrie s dia-PASEF metodou.
• Gradienty: 10minutový (120 vzorků/den) a 6minutový (220 vzorků/den).
• Příprava vzorků: iST-BCT kit pro neat plazmu, ENRICH-iST kit pro obohacenou plazmu.

Hlavní výsledky a diskuse

Výsledky ukázaly:

• Neat plazma: identifikace 450–550 proteinových skupin ve 7minutovém gradientu.
• ENRICH plazma: 670–1150 proteinových skupin, přičemž až 1200 skupin v single-spun vzorcích.
• Opakovatelnost: ~80–85 % překryv bílkovin mezi jednou a dvakrát odstředěnou plazmou.
• Vysoká stabilita retence a úzké chromatografické píky s průměrem 5 datových bodů na pík.
• Nulový carry-over i při opakovaných injekcích vysokých koncentrací.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizace cap-flow LC a dia-PASEF poskytuje:

• Výrazné zrychlení analýzy (až 220 vzorků/den).
• Robustní kvantifikaci proteinů napříč velkými kohortami.
• Možnost hluboké proteomické sondy s nízkými odběrovými objemy (400 ng peptidu).
• Omezení doby regenerace kolony a celkového času analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry vývoje:

• Další zkracování gradientů a zvýšení propustnosti na >300 vzorků/den.
• Integrace automatizované přípravy vzorků pro eliminaci variability.
• Vývoj úprav dia-PASEF metodiky pro specifické třídy proteinů a post-translační modifikace.
• Implementace strojového učení pro rychlou analýzu a interpretaci dat.

Závěr

Popsaná optimalizace cap-flow LC a dia-PASEF MS umožňuje rychlou, reprodukovatelnou a vysoce propustnou analýzu plazmatického proteomu. Metoda je vhodná pro rozměrné klinické studie, kde je potřeba zpracovat stovky vzorků s vyšší hloubkou proteomického pokrytí.

Reference

• Nolte H., MacVicar T.D., Tellkamp F. et al. Instant Clue: A Software Suite for Interactive Data Visualization and Analysis. Sci Rep 8, 12648 (2018).