Monitoring Antibody Glycosylation at Intact and Subunit Levels Using a Single Quadrupole LC/MS

Význam tématu

Glykosylace hraje klíčovou roli ve strukturní stabilitě, biologické aktivitě a bezpečnosti monoklonálních protilátek. Pravidelná kontrola relativních zastoupení jednotlivých glykovaných forem je nezbytná pro zajištění kvality a reprodukovatelnosti bioléčiv v produkčním procesu.

Cíle a přehled studie / článku

Studie demonstruje využití LC/MS platformy Agilent InfinityLab Pro iQ Plus pro sledování glykosylace protilátky trastuzumab na intaktní úrovni i po redukci na lehký a těžký řetězec. Cílem bylo ověřit, zda lze s touto single quadrupole instrumentací dosáhnout spolehlivých relativních abundancí srovnatelných s high-resolution systémy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek trastuzumabu byl denaturován guanidinem, redukován DTT a okyselen formiátovou kyselinou. Chromatografie probíhala na PLRP-S koloně pomocí gradientu vody a acetonitrilu s formiátovou kyselinou. MS detekce byla nastavena v pozitivním módu, spektra dekonvoluována v OpenLab CDS se specifickými parametry pro intaktní i redukovanou formu.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II Bio LC System
• Agilent InfinityLab Pro iQ Plus Single Quadrupole Mass Spectrometer
• Agilent Jet Stream ESI zdroj
• PLRP-S kolona 2.1 × 50 mm, 5 μm

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní trastuzumab vykázal pět hlavních glykovaných forem s relativními abundancemi („G0+G0F“, „G0F+G0F“, „G0F+G1F“, „G1F+G1F“, „G1F+G2F“) shodnými s daty z přesnějších hmota-spektrálních přístrojů. Po redukci byla lehkého řetězce detekována jedna nenaklonovaná forma, těžký řetězec vykázal čtyři glykované formy (G0, G0F, G1F, G2F). Kvalita dekonvoluce a tvaru syrových spekter potvrzuje spolehlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlou a reprodukovatelnou analýzu glykosylace bez potřeby nákladných high-resolution přístrojů. Je ideální pro rutinní QC monitoring glykoform v biopharmaceutické výrobě a zkracuje dobu analýzy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikace na další monoklonální protilátky a Fc-fúzní proteiny, integrace s automatizovanou přípravou vzorků, vypracování kvantitativních glykoanalytických protokolů a kombinace s pokročilými strukturálními technikami.

Závěr

Agilent InfinityLab Pro iQ Plus single quadrupole LC/MS dokáže spolehlivě sledovat relativní zastoupení glykovaných forem protilátek na intaktní i subunit úrovni. Výsledky jsou srovnatelné s high-resolution systémy, přičemž platforma nabízí jednoduchý a nákladově efektivní provoz pro rutinní QC.

Reference

1. Higel F. a kol. N-glycosylation Heterogeneity and the Influence on Structure, Function and Pharmacokinetics of Monoclonal Antibodies And Fc Fusion Proteins. Eur. J. Pharm. Biopharm. 2016, 100, 94–100.
2. Wang D. a kol. Comprehensive Analysis of the Glycan Component of SARS-CoV-2 Spike Proteins Using Signature Ions-Triggered Electron-Transfer/Higher-Energy Collisional Dissociation (EThcD) Mass Spectrometry. Anal. Chem. 2020, 92(21), 14730–14739.