Sample Pre-treatment Procedures for Bioanalytical Samples

Význam tématu

Preanalytická úprava biologických vzorků je nezbytná pro odstranění matricových interferencí (proteiny, buňky, konjugáty), což významně zvyšuje spolehlivost a přesnost následné chromatografické či hmotnostně spektrometrické analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem technické poznámky je představit souhrn běžně používaných postupů předúpravy pro různé bioanalytické matrice: plasma/serum, plnou krev, sliny, moč a tkáně. Text shrnuje optimální postupy proteinové precipitace, hemolýzy, hydrolýzy a homogenizace.

Použitá metodika

• Plasma/Serum: Proteiny se disrupují pomocí 2 % H3PO4 pro kyselé analyty nebo 0,1 M NaOH pro bazické. Po vortexování a centrifugaci se získaný supernatant připraví pro další analýzu.
• Plná krev: Pro analyty v erytrocytech se provede hemolýza (zinek síran/methanol), osmotické rozrušení (voda + centrifugace) nebo sonikace následovaná pH úpravou a centrifugací. Fyzičké postupy (sonikace s pufrem) vykázaly nejvyšší recovery a zabránily ucpávání SPE kolonek.
• Sliny: Nepožaduje se hydrolýza, lze použít stejný protokol jako pro plasma/serum.
• Moč: Pro konjugované formy analyzů se aplikuje enzymatická hydrolýza (beta-glukuronidáza, pH 4–5, 63 °C, 30 min) nebo chemická hydrolýza (zásaditá či kyselá) s následnou úpravou pH.
• Tkáně: Homogenizace v organickém či vodném extrakčním prostředí, filtrace/centrifugace a přímá extrakce metodou matrix solid phase dispersion (MSPD).

Použitá instrumentace

• Vortex mixer
• Stolní centrifuga (až 14 000 rpm)
• Sonikátor
• Vodní lázeň
• Volumetrické baňky a laboratorní pipety

Hlavní výsledky a diskuse

Komparativní studie pre-treatment postupů pro plnou krev prokázala, že fyzikální denaturace (sonikace v pufru) poskytuje vyšší výtěžnost než chemické metody, přičemž minimalizuje riziko ucpání kolonek. Enzymatická hydrolýza moče efektivně uvolňuje konjugované analyty za přísných podmínek pH a teploty. Proteinová precipitace v plazmě/seru spolehlivě narušuje vazbu analytů na bílkoviny.

Přínosy a praktické využití metody

• Zvýšení přesnosti a reprodukovatelnosti bioanalytických měření
• Lepší kompatibilita s následnou SPE a chromatografickými technikami
• Minimalizace rizika kontaminace a ucpání kolonek

Budoucí trendy a možnosti využití

Automatizace a miniaturizace preanalytických kroků na mikroplatové formáty, integrace on-line pre-treatment procesů s chromatografií, vývoj ekologičtějších rozpouštědel a nových enzymatických systémů pro cílenou hydrolýzu konjugátů.

Závěr

Komplexní přístup k preanalytické přípravě vzorků podle druhu matrice zajišťuje vysokou kvalitu bioanalytických dat. Volba vhodné metody – chemická či fyzikální – významně ovlivňuje výtěžnost, selektivitu a spolehlivost následné analýzy.

Reference

• Chen et al., J. Anal. Toxicol. 1992, v18, s. 352–355