Novel bacterial classification method by MALDI-TOF MS based on ribosomal protein coding in S10-spc-alpha Operon at Strain level

Význam tématu

Whole-cell MALDI-TOF MS představuje rychlou a jednoduchou proteomickou metodu pro identifikaci bakterií, ale tradiční proteinové otisky prstů neumožňují dostatečné rozlišení na úrovni kmenů. Strain-level typizace je klíčová pro sledování šíření patogenů, spolehlivou klasifikaci a kontrolu kvality v průmyslové a klinické praxi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout novou metodu S10-GERMS (S10-spc-alpha operon Gene Encoded Ribosomal Protein Mass Spectrum) pro fylogenetickou klasifikaci bakterie Pseudomonas syringae na úrovni pathovarů a kmenů. Metoda kombinuje cílenou analýzu ribozomálních proteinů kódovaných v operonu S10-spc-alpha s databází teoretických a experimentálních hmotností.

Použitá metodika

• Analýza bakteriálních kmenů pomocí WC-MALDI-TOF MS pro získání pozorovaných hmotností proteinů
• DNA sekvenování operonu S10-spc-alpha a překlad do aminokyselinových sekvencí
• Výpočet teoretických hmotností ribozomálních podjednotek (zohlednění ztráty N-koncového methioninu)
• Porovnání teoretických a pozorovaných hmotností pro vytvoření přesné pracovní databáze biomarkerů
• Typizace nových kmenů P. syringae na základě profilů vybraných ribozomálních proteinů

Použitá instrumentace

• Spektrometrie MALDI-TOF: AXIMA Performance (Shimadzu/Kratos)
• Režim ladění: lineární, pozitivní ionizace
• Matrix: sinapinová kyselina 10 mg/mL v 50 % acetonitrilu s 1 % TFA
• Příprava vzorku: resuspendované celky bakterií v TMA-I pufru, smíchání s matrix a nanesení na MALDI desku

Hlavní výsledky a diskuse

Pro diskriminaci P. syringae bylo vybráno 14 ribozomálních proteinů (L36, L30, L29, S17, S19, L23, L24, S14, S10, L22, L18, S13, S11, S08) kodovaných v operonu S10-spc-alpha. Dvě doplňkové podjednotky (S16, S12) zvýraznily rozlišovací schopnost na úrovni pathovarů.
Pomocí vytvořené databáze byla sedmice komerčně dostupných kmenů P. syringae úspěšně rozdělena do pěti skupin, které odpovídají jejich pathovarům. Výsledky potvrzují vysokou reprodukovatelnost i specifitu biomarkerů.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a jednodušší alternativa k nákladným metodám celogenomového sekvenování
• Možnost přiřazení hmotnostních signatur i u nesekvenovaných kmenů
• Využití ve sledování epidemiologie patogenů, potravinářských a farmaceutických kontaminací

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření databáze o další bakterie pro univerzálnější aplikaci
• Integrace s pokročilou bioinformatikou a strojovým učením pro automatizovanou klasifikaci
• Aplikace v klinické diagnostice detailní typizace rezistentních kmenů

Závěr

Metoda S10-GERMS efektivně rozšiřuje potenciál WC-MALDI-TOF MS pro diskriminaci bakterií na úrovni kmenů a pathovarů. Kombinace gene prom operonu S10-spc-alpha s hmotnostní analýzou ribozomálních proteinů umožňuje rychlou, přesnou a prakticky využitelnou typizaci.

Reference

1. Pineda F.J. et al., Anal. Chem., 2003, 75, 3817–3822
2. Teramoto K. et al., Anal. Chem., 2007, 79, 8712–8719
3. Hotta Y. et al., J. Proteome Res., 2011, 9, 6722–6728
4. Tamura H. et al., J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2013; doi:10.1007/s13361-013-0627-8