High-throughput and sensitive HPLC analysis of lipids used in LNP formulations with evaporative light scattering detection

Význam tématu

Lipidové nanočástice (LNP) představují klíčový vektor pro podávání mRNA vakcín proti onemocnění COVID-19 i dalších terapeutických sloučenin. Jejich složení, kvalita a bezpečnost jsou zásadní pro účinnost a spolehlivost léčivých přípravků. Rychlá a spolehlivá analýza lipidů v těchto formulacích zajišťuje důkladnou kontrolu kvality během vývoje i výroby.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout vysoce průchodné (high-throughput) metody HPLC s detekcí odpařovacím rozptylem světla (ELSD) pro kvantifikaci a identifikaci jednotlivých lipidů používaných v LNP formulacích. Práce zahrnovala srovnání dvou typů fenyl-hexyl stacionárních fází (core-shell vs. plně pórovité), optimalizaci gradientních a isokratických režimů a stanovení hranic detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ).

Použitá metodika a instrumentace

Pro vývoj metod byla použita HPLC soustava KNAUER AZURA® s nízkotlakým kvaternárním gradientním čerpadlem a autosamplerem. Detekce byla realizována přístrojem SEDEX 100LT (ELSD) s optimalizovanou teplotou odpařování 35 °C a dusíkovým tlakem 3,5 bar. Analýzy probíhaly na fenyl-hexyl kolonkách:

• Core-shell 1,7 μm, 100 Å, 2,1×50 mm
• Plně pórovitá ChromCore 1,8 μm, 120 Å, 2,1×50 mm

Mobilní fáze zahrnovaly vodu s 10 mM acetátem amonným a směs acetonitrilu a methanolu. Testovány byly gradientní režimy s pozvolným nárůstem organické složky i úsporné isokratické běhy.

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání gradientních a isokratických metod ukázalo, že kombinace acetonitrilu a methanolu s acetátem amonným poskytuje rovnoměrný tvar špiček a kompletní eluční profil čtyř klíčových lipidů (cholesterol, DSPC, ionizovatelné a PEGylované lipidy) během 2–4 minut. Isokratické metody dosáhly separace za 2–3 minuty bez potřeby reekvilibrace, což výrazně zrychluje měření. LODs byly v rozmezí 0,8–3 μg/ml (4–15 ng), LOQs 0,9–4 μg/ml (5–32 ng). Plně pórovitá fáze vykázala mírně vyšší retenci a o něco lepší citlivost ve srovnání s core-shell.

Přínosy a praktické využití metody

Metody umožňují vysokorychlostní kvantifikaci lipidů v LNP formulacích s nízkými LOD a LOQ, což je nezbytné pro rutinní kontrolu kvality ve výzkumu i výrobě vakcín a terapeutik. Flexibilita gradientních a isokratických režimů poskytuje možnost volby mezi maximálním rozlišením a nejkratší dobou analýzy. Přenositelnost na binární LC-MS systémy usnadňuje další rozšíření aplikací.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se integrace HPLC-ELSD metod s hyphenovanou hmotnostní spektrometrií pro detailní charakterizaci lipidových složek a nečistot. Další miniaturizace kolonek a využití monolitických stacionárních fází mohou dále zkrátit časy analýzy. Technologie LNP nalézá uplatnění i mimo vakcíny, například při cílené distribuci genové terapie, protinádorových látek či léčbě dědičných onemocnění.

Závěr

Vyvinuté HPLC-ELSD metody na základě fenyl-hexyl stacionárních fází poskytují robustní, citlivé a rychlé nástroje pro hodnocení lipidové kompozice LNP. Gradientní i isokratické režimy jsou vhodné pro různá provozní nastavení, přičemž plně pórovitá fáze mírně převyšuje core-shell z hlediska citlivosti. Tyto postupy podporují efektivní QA/QC ve vývoji i výrobě mRNA vakcín a dalších nanofarmaceutik.

Reference

1. Albertsen H. et al. Adv Drug Deliv Rev. 2022, 188, 114416.
2. USP Draft Guidelines for mRNA Vaccine Quality, Edition 2, 2024.
3. Schneider S., Agilent Technologies Application Note 5994-6051EN, 2023.
4. Alden B. A. et al., Waters Corp. Application Note 720007331, 2021.
5. Schneider S., Agilent Technologies Application Note 5994-4709EN, 2022.
6. Higuchi A. et al. Polymer Reviews. 2023, 63, 394–436.
7. Kinsey C. et al. Electrophoresis. 2022, 43, 1091–1100.