Explore AAV buffers and stability with Big Tuna and Uncle

Význam tématu

Gene therapy využívající AAV vektory vyžaduje optimální formulaci pro zachování infekčnosti a stability během čištění a skladování. Výběr vhodného pufru, jeho pH a iontové síly významně ovlivňuje výnos, kvalitu a funkčnost vektorů. Tradiční metody výměny pufru a testování stability jsou časově náročné, vyžadují velké objemy vzorku a poskytují nízkou propustnost.

Cíle a přehled studie

Cílem aplikace bylo ukázat propojení automatizované výměny a koncentrace pufrů pomocí systému Big Tuna s multimodální analýzou stability AAV pomocí platformy Uncle. Testování proběhlo na AAV9 v pěti různých formulacích a kontrolních podmínkách, zahrnujících procesní kontrolu (PBS) a negativní kontrolu (citráto-fosfát pH 4).

Použitá metodika a instrumentace

• Vzorek: AAV9-CMV-GFP (7×10¹¹ cp/mL) v PBS s 0,001 % Pluronic F68.
• Automatizovaná výměna pufru: Big Tuna, 96-well ultrafiltrační deska (10 kDa), 96 % výměny pufru na pool, 33 % odstraněné objemu na cyklus, 5 cyklů, závěrečná koncentrace 2× do 190 µL.
• Analýza stability: Uncle, 9 µL vzorku, tepelný rampový protokol 15–95 °C při 0,4 °C/min; detekce intrinsické fluorescence (266 nm), SDS-SLS a DLS pro agregaci a SYBR Gold pro sledování genomu.

Hlavní výsledky a diskuse

• Recovery po výměně a koncentraci pufru: 96–101 % v PBS, Na₂HPO₄ pH 6,5, Tris pH 8,0 a NaAcetát pH 5,0; 71 % v citráto-fosfát pH 4,0.
• Počáteční DLS: většina vzorků monodisperzní částice ~25 nm, citráto-fosfát vykázal agregáty ~120 nm odpovídající snížené recovery.
• Tepelná stabilita: capsid unfolding Tm ~76–77 °C ve čtyřech pufrech, snížená Tm na 71,7 °C v citráto-fosfát pH 4.
• Genome ejection a agregace: v citráto-fosfátu nižší Tm pro uvolnění genomu a Tagg ~43,5 °C, v PBS agregace blíže k capsid unfolding, odlišné profily ukazují vliv formulace.

Přínosy a praktické využití metody

Platformy Big Tuna a Uncle výrazně zrychlují screening formulací AAV, snižují potřebu vzorku a umožňují paralelní analýzu až 96 podmínek. Usnadňují optimalizaci procesů vývoje, zkracují dobu potřebnou pro charakterizaci stability a podporují QA/QC v gene therapy výrobcích.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metod pro další serotypy AAV a jiné virové vektory.
• Integrace do GMP prostředí a plně automatizované výrobní linky.
• Kombinace s dalšími strukturálními (EM) a funkčními (transdukční) testy pro komplexní charakterizaci.

Závěr

Kombinace Big Tuna a Uncle poskytuje robustní, vysokopropustný a reprodukovatelný workflow pro výměnu pufrů, koncentraci a komplexní analýzu stability AAV. Tento přístup usnadňuje optimalizaci formulací, zvyšuje efektivitu vývoje a podporuje implementaci v průmyslových a klinických podmínkách.

Reference

• Hsu H. et al., Nature Communications 2020;11(1):3279.
• Bernaud J. et al., Journal of Biological Physics 2018;44(2):181–94.
• Potter M. et al., Molecular Therapy - Methods and Clinical Development 2014;1:14034.
• Brument N. et al., Molecular Therapy 2002;6(5):678–86.