Using the Spectral Evaluation Function for Quantitative Analysis of Nucleotides and a Simultaneous Pass/Fail Judgment on Nucleotide Sample Purity

Význam tématu

UV-Vis spektrofotometrie je klíčová pro kvantitativní stanovení nukleových kyselin na základě Beer-Lambertova zákona. Současně umožňuje kontrolu čistoty vzorku, která je zásadní pro spolehlivost následných biochemických analýz.

Cíle a přehled studie

Studie demonstruje použití spektrofotometru Shimadzu UV-1900i Plus a softwaru LabSolutions UV-Vis s funkcí Spectral Evaluation pro kvantitativní analýzu oligonukleotidů a současné vyhodnocení čistoty vzorku pass/fail pomocí poměru OD260/OD280. Porovnávají se kalibrační křivky pro pevnou vlnovou délku 260 nm a pro vlnovou délku maxima absorpce.

Použitá metodika a instrumentace

• Spektrofotometr: Shimadzu UV-1900i Plus
• Software: LabSolutions UV-Vis (aplikace Spectrum, Quantitation, funkce Spectral Evaluation)
• Buňky: Super-Micro Cell Holder s 10 mm mikro black cell
• Podmínky měření: rozsah 220–400 nm, interval dat 0,5 nm, střední rychlost skenu, šířka štěrbiny 1 nm
• Vzorky: oligonukleotidy M13-F25mer v koncentracích 0,2–10,0 ng/µl

Hlavní výsledky a diskuse

• Kalibrace při 260 nm vykázala koeficient korelace r2 = 0,99969.
• Kalibrace na vlnové délce maxima absorpce (λmax 257–259 nm v závislosti na koncentraci) dosáhla r2 = 0,99992 a prokázala vyšší přesnost.
• Funkce Spectral Evaluation umožnila nastavit prahový poměr OD260/OD280 ≥ 1,8 pro kontrolu čistoty.
• Modelový vzorek s přídavkem BSA vykázal OD260/OD280 = 1,3, koncentraci 0,4 ng/µl a neprošel kritériem čistoty.

Přínosy a praktické využití metody

Integrované řešení pro simultánní stanovení koncentrace a kontroly čistoty nukleových kyselin v jednom měření. Významné pro přípravu vzorků pro sekvenační analýzy, termostabilitu (Tm) i termodynamické studie.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření Spectral Evaluation na další biomolekuly a barviva.
• Integrace s automatizovanými vysokokapacitními systémy.
• Vývoj adaptivních kalibrací v reálném čase zohledňujících změny spektrálních charakteristik.

Závěr

Implementace funkce Spectral Evaluation se spektrofotometrem UV-1900i Plus a LabSolutions UV-Vis poskytuje vysoce přesnou kvantitativní analýzu nukleových kyselin a efektivní kontrolu jejich čistoty v jednom kroku měření.

Reference

• Braglia L., Giani S., Breviario D., Gavazzi F. Anal. Bioanal. Chem., 408, 8299 (2016).