Advancing Sensitivity and Efficiency in Released N-Linked Glycan Analysis With the ACQUITY™ QDa™ II Mass Detector

Význam tématu

Glykozylace proteinů je klíčovou posttranslační modifikací ovlivňující jejich složení, složení glykanů má přímý dopad na skládání, stabilitu a farmakologické vlastnosti monoklonálních protilátek. Přesné monitorování N-vázaných glykanů je zásadní pro udržení kvality a účinnosti léčiv v regulovaných výrobních procesech.

Cíle a přehled studie / článku

Tato studie představuje aplikaci nové generace jednochodých kvadrupólových detektorů ACQUITY QDa II Mass Detector ve spojení s ACQUITY Premier systémem a HILIC chromatografií pro rychlou, citlivou a specifickou analýzu uvolněných N-glykanů z monoklonálních protilátek. Hlavním cílem bylo doplnit stávající fluorescenční workflow, zvýšit schopnost detekce nízkoabundantních impurit (např. Man-5) a zjednodušit interpretaci dat.

Použitá metodika

• Uvolnění N-glykanů z mAb a značení RapiFluor-MS reagensem pro zvýšení citlivosti FLR i MS detekce
• Separace HILIC na sloupci ACQUITY Premier Glycan BEH Amide (2.1×150 mm, 1.7 µm, 130 Å)
• Fluorescenční detekce (λexc=265 nm, λem=425 nm) paralelně s hmotnostní detekcí ESI+, rozsah m/z 350–1500
• Kalibrace retenčních časů dextranovou žebříkovou směsí a výpočet GU hodnot pomocí cubic spline fit v Empower 3
• Analýza kritické Man-5 glykanové impurity selektivním ionovým záznamem (SIR) pro eliminaci šumu a koeluce

Použitá instrumentace

• ACQUITY Premier System
• ACQUITY QDa II Mass Detector
• ACQUITY Premier Glycan BEH Amide Column (130 Å, 1.7 µm, 2.1×150 mm)
• ACQUITY FLR Detector
• Empower 3.8.1 Software

Hlavní výsledky a diskuse

• Reprodukovatelnost GU kalibrace: odchylka experimentálních hodnot <0,05 GU potvrzuje vysokou konzistenci mezi laboratorními běhy
• Empower zobrazuje integrované FLR a MS chromatogramy, TIC, XIC a spektra jedním pohledem
• Rozšířený mass range až do 1500 m/z umožňuje analýzu všech glycans v ionizačním stavu [M+2H]2+, což zjednodušuje interpretaci
• SIR detekce Man-5 glykanů odhaluje nízkoabundantní impurity skryté v běžném chromatogramu

Přínosy a praktické využití metody

• Dodatečná hmotnostní informace bez zvyšování složitosti analytického workflow
• Zvýšená citlivost a specifita pro klíčové kvalitatívní atributy (CQA) mAb
• Kompatibilita s regulovanými prostředími díky integraci Empower a robustní konstrukci
• Nízká spotřeba energie a provozní náklady díky kompaktnímu designu QDa II

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vysokopropustná automatizace glykanových analýz a rozšíření nasazení v online výrobních monitorovacích systémech
• Integrace s dalšími detekčními metodami (MS/MS, MALS) pro komplexní charakterizaci bílkovin
• Využití pokročilých algoritmů a umělé inteligence pro automatizovanou interpretaci hmotnostních dat
• Vývoj nových derivatizačních reagentů pro rychlejší a citlivější glykanové screeningy

Závěr

ACQUITY QDa II Mass Detector nabízí ve srovnání s předchozími generacemi vylepšenou citlivost, rozšířený rozsah m/z a plynulou integraci do existujících FLR workflow. Robustnost, energetická efektivita a schopnost detekovat i nízkoabundantní impurity, jako je Man-5 glykan, zajišťují spolehlivou kontrolu kvality v regulovaných výrobních laboratořích.

Reference

• Luo S., Zhang B. Benchmark Glycan Profile of Therapeutic Monoclonal Antibodies Produced by Mammalian Cell Expression Systems. Pharmaceutical Research. 2024;41:29–37.
• Lauber M. A., Koza S. M., Turner J. E., Iraneta P. C., Fountain K. J. Amide-Bonded BEH HILIC Columns for High Resolution, HPLC-Compatible Separations of N-Glycans. Waters Application Note. 2013;720004857.
• Birdsall R. E., Kellett J., Zhang X., Yu Y. Q. Increasing Consistency Across Biopharmaceutical Labs with the ACQUITY Premier LC Platform. Waters Application Note. 2021;720007415.
• Goetze A. M. et al. High-mannose glycans on the Fc region of therapeutic IgG antibodies increase serum clearance in humans. Glycobiology. 2011;21(7):949–59.
• Yu M. et al. Production, characterization, and pharmacokinetic properties of antibodies with N-linked mannose-5 glycans. mAbs. 2012;4(4):475–87.