Optimize your HPLC-UV system for applications with trifluoroacetic acid (TFA)

Význam tématu

Trifluoroctová kyselina (TFA) se v kapalinové chromatografii využívá jako iontově párující činidlo zejména při analýze peptidů a proteinů. Díky silným absorbčním vlastnostem pod 250 nm může TFA v mobilní fázi způsobovat nestabilní základní linii UV detektoru, což negativně ovlivňuje citlivost metody, zejména meze detekce (LOD) a kvantifikace (LOQ). Optimalizace objemu směšovacího modulu čerpadla je klíčová pro minimalizaci těchto rušivých efektů a zajištění spolehlivých výsledků.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřuje na kvantifikaci vlivu různých objemů mixerů (100, 200, 400 a 600 µl) na kvalitu základní linie při gradientu typicky používaném pro peptidové analýzy s 0,1–0,5 % TFA v eluentech. Cílem bylo určit optimální objem mixeru, který minimalizuje baseline ripple bez nadměrného prodloužení gradient delay volume (GDV).

Použitá metodika a instrumentace

Mobilní fáze byla složena z eluentu A (voda + 0,1 % TFA) a eluentu B (acetonitril + 0,085 % TFA). Gradient probíhal z 5 % B do 55 % B v čase 0,1–30 min při průtoku 0,6 ml/min a teplotě kolony 25 °C. Komponenty použité v měření:

• Pumpa AZURA P 6.1L s 5 ml pumpovací hlavou (stainless steel)
• Autosampler AZURA AS 6.1L
• Kolona Thermo Fisher Scientific Accucore aQ C18, 100 × 2,1 mm, částice 2,6 μm
• Detektor AZURA DAD 2.1L s LightGuide UV flow cell (10 mm, 1/16", 2 μl)
• Mixery AZURA o objemech 100, 200, 400 a 600 µl
• Software ClarityChrom 9.0 s PDA Extension

Hlavní výsledky a diskuse

S narůstajícím objemem mixeru došlo ke znatelnému snížení amplitudy baseline ripple. Nejčistší základní linii vykazoval mixer 600 µl, následován 400 µl, zatímco 100 µl modul výrazně zvýrazňoval pulzační šum z čerpadla. Zvýšení objemu mixeru však také vedlo k nárůstu gradient delay volume, což mírně prodlužuje dobu analýzy. Výsledky potvrzují, že pro aplikace s TFA je kompromisem mezi hladší bází a délkou analýzy optimální volbou mixer v rozsahu 400–600 µl.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizace mixeru umožňuje dosáhnout stabilnější základní linie a tím zlepšit detekční a kvantifikační parametry chromatografických metod s TFA. To přináší vyšší přesnost a reprodukovatelnost výsledků, což je klíčové pro proteomické analýzy, farmaceutický vývoj a QA/QC laboratoře pracující s peptidovými vzorky.

Budoucí trendy a možnosti využití

Trend směřuje k nasazení moderních mikrofluidních mixerů s optimalizovaným interním designem pro maximální homogenizaci při minimálním mrtvém objemu. Výhledově lze očekávat vývoj adaptivních systémů, které budou automaticky volit optimální objem mixeru podle složení elučních fází a požadované citlivosti detekce.

Závěr

Volba vhodného objemu mixeru má zásadní vliv na kvalitu základní linie UV detektoru při použití TFA v eluentech. Pro vyvážený poměr mezi hladkostí baseliny a minimálním gradient delay volume se doporučuje objem mixeru 400–600 µl. Nasazení moderních mikrofluidních mixerů významně přispívá k optimalizaci citlivosti a spolehlivosti HPLC-UV metod v proteinových a peptidových aplikacích.

Reference

[1] Choikhet et al, The Physicochemical Causes of Baseline Disturbances in HPLC, Part I – TFA-Containing Eluents, LCGC Europe, 2003
[2] Strobl et al, TN-72505, KNAUER Wissenschaftliche Geräte GmbH, 2017