Development and optimization of LNP formulations – using the KNAUER NanoScaler

Význam tématu

Aplikace lipidových nanočástic (LNP) jako nosičů nukleových kyselin se stala klíčovou technologií v preklinickém i klinickém výzkumu. LNP nabízejí biokompatibilitu, biodegradabilitu, vysokou účinnost enkapsulace a možnost rychlé, reprodukovatelné a škálovatelné výroby, jak ukázaly vakcíny proti SARS-CoV-2.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo optimalizovat proces formulace LNP s různými nukleovými kyselinami (mRNA, pDNA) pomocí nové laboratorní jednotky NanoScaler založené na technologii Impingement Jets Mixing (IJM). Autoři hodnotili vliv parametrů jako celková rychlost toku, poměr fází, počáteční koncentrace lipidů a možnost in-line ředění na velikost, polydisperzitu a účinnost enkapsulace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu LNP byly použity:

• NanoScaler (KNAUER) s pěti velikostmi IJM
• Herringbone mikrofluidický mixer (Darwin Microfluidics) pro srovnání
• Pumpy pro organickou a vodnou fázi
• Vivaspin 500 (Sigma) a TFF hollow fiber 50 kDa pro odstranění etanolu
• DLS (Stunner, Unchained Labs) pro měření velikosti a PdI
• Quant-iT RiboGreen pro stanovení účinnosti enkapsulace
• In vitro transfuze HepG2, HeLa, HEK293 s luciferázovým testem (Bright-Glo, Promega)
• HPLC-CAD pro kontrolu čistoty po čištění

Hlavní výsledky a diskuse

Formulace pDNA-LNP vedla k větším částicím (110–130 nm) než u mRNA-LNP (80–100 nm) s PdI <0,2 a účinností enkapsulace >90 %. Optimální rozmezí celkové rychlosti toku (TFR) bylo identifikováno mezi 2 a 4 ml/min pro cílovou velikost 70–90 nm. Porovnání s Herringbone mikromixerem prokázalo obdobné charakteristiky, přičemž NanoScaler produkoval menší mRNA-LNP. Zvýšení počáteční koncentrace lipidů nad 2,9 mg/ml neovlivnilo negativně vlastnosti LNP. In-line ředění neprokázalo zásadní změnu v parametrech LNP. Škálování z 1 ml na 50 ml a dále na objemy řádu litrů při použití různých IJM mixerů potvrdilo reprodukovatelnost a robustnost technologie. Čištění systému vodou, ethanolem a NaOH odstranilo zbytky lipidů a nukleových kyselin. Transfekční studie ukázaly vysokou účinnost mRNA-LNP, zejména v buněčných liniích HepG2.

Přínosy a praktické využití metody

LNP formulované s NanoScalerem lze vyrábět s vysokou rychlostí a reprodukovatelností od malých objemů v R&D až po komerční dávky. Modulární IJM mixer umožňuje flexibilní škálování, in-line ředění zvyšuje automatizaci a čištění zkracuje prostoje mezi výrobními cykly.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření kontinuální výroby LNP, integrace inline analytik pro sledování kvality a vývoj cílených nosičů s novými chemickými modifikacemi lipidů. Technologie může podporovat personalizované vakcíny a genové terapie s různými payloady.

Závěr

NanoScaler představuje univerzální platformu pro vývoj a průmyslovou výrobu lipidových nanočástic s vysokou kontrolou kvality a možností rychlého škálování. Prokázané vlastnosti usnadňují přechod od preklinického výzkumu do komerční výroby.

Reference

1. Anderson EJ et al. Safety and immunogenicity of SARS-CoV-2 mRNA-1273 vaccine in older adults. N Engl J Med. 2020;383(25):2427–2438.
2. Polack FP et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. N Engl J Med. 2020.
3. Hou X et al. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 2021;6(12):1078–1094.
4. KNAUER. KNAUER is expanding its business activities into the field of lipid nanoparticle production equipment. n39517.
5. BioNTech Investors. COVID-19 vaccine partners.
6. CNN. Pfizer vaccine manufacturing. 2021.