Analytical Methods to Qualify and Quantify PEG and PEGylated Biopharmaceuticals

Význam tématu

Polyethylen glykol (PEG) a PEGylace proteinů jsou klíčové pro moderní bioterapeutika.
Zvyšují biologickou dostupnost, snižují imunitní reaktivitu a zlepšují fyzikálně-chemickou stabilitu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a hodnotit dvourozměrnou kapalinovou chromatografii (2D LC) vybavenou detekcí nabitými aerosoly pro:

• současnou charakterizaci rozsahu PEGylace proteinu,
• kvantifikaci nevyužitého PEG-reaktantu a jeho vedlejších produktů.

Použitá metodika a instrumentace

• Online 2D LC systém Thermo Scientific Dionex UltiMate 3000 x2 Dual RSLC s DPG-3600RS pumpou, WPS-3000TRS autosamplerem, TCC-3000RS termostatovanou komorou, dvěma vysokotlakými ventily a detektorem DAD-3000RS.
• Charged Aerosol Detector: Thermo Scientific Dionex Corona ultra RS, nutné použít těkavé mobilní fáze.
• Sloupcová kombinace:
  • 1. dimenze: MAbPac SEC-1 (5 μm, 300 Å, 4 × 300 mm) pro dělení podle velikosti,
  • 2. dimenze: Acclaim C8 (3 μm, 3 × 150 mm) pro reverzní fázi.
• Mobilní fáze:
  • A: 100 mM acetát amonný, pH 6,7; B: acetonitril; C: deionizovaná voda.
• Online příprava vzorků a reakce pomocí vlastních programů v Chromeleon CDS 7.1.
• Vzorky: imunoglobulin G (IgG) a albumin (BSA) s různým molárním násobkem MS(PEG)8.

Hlavní výsledky a diskuse

• 2D LC režim efektivně oddělil PEGylované proteiny od nevyužitého reaktantu a solí.
• Charged aerosol detektor umožnil kvantifikaci i nechromoforických PEG sloučenin.
• IgG a BSA vykázaly posun retenčních časů v SEC i C8 dimenzi úměrně molárnímu násobku reaktantu.
• Online monitorování odhalilo lineární vztah mezi množstvím reaktantu a mírou PEGylace s nasycovacím efektem při vyšších násobcích.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a spolehlivá analýza míry PEGylace proteinů bez potřeby extrakce nebo offline odběru frakcí.
• Možnost optimalizace poměru reaktantu k proteinu v reálném čase.
• Široké uplatnění v biofarmaceutickém vývoji, QC a analytickém výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s hmotnostní spektrometrií pro identifikaci a potvrzení struktury PEGylovaných forem.
• Automatizace 2D LC procesů a rozšíření na jiné typy modifikací biopolymerů.
• Využití v biotechnologické výrobě pro kontinuální monitorování procesů PEGylace.

Závěr

Dvourozměrná LC s nabitou aerosolovou detekcí poskytuje komplexní nástroj pro kvalifikaci a kvantifikaci PEGylovaných proteinů i zbylých reaktantů.
Online přístup zefektivňuje optimalizaci reakčních podmínek a zkracuje dobu analýzy.

Reference

1. Morar S, Schrimsher J, Chavez M. PEGylation of Proteins: A Structural Approach. BioPharm Int. 2006;4:34–36.
2. Huang L, Gough P, DeFelippis M. Characterization of Poly(ethylene glycol) and PEGylated Products by LC/MS with Postcolumn Addition of Amines. Anal Chem. 2009;81:567–577.
3. Kou D, Manius G, Zhan S, Chokshi H. Size Exclusion Chromatography with Corona Charged Aerosol Detector for the Analysis of Polyethylene Glycol Polymer. J Chromatogr A. 2009;1216(28):5424–5428.
4. Thermo Fisher Scientific. MS(PEG)n Reagents; Instructions 1767.4; 2011.