Flash Characterization of mAbs Using a Combination of Reagents via Automated On-Line Microdroplet Reaction

Význam tématu

Rychlá a spolehlivá charakterizace monoklonálních protilátek (mAb) je klíčová v biotechnologickém vývoji, výrobě léčiv a kvalitativním zajištění (QA/QC). Tradiční analýzy často vyžadují časově náročné kroky a větší množství materiálu. Microdroplet reakce představují inovativní přístup, kdy se enzymatické štěpení, redukce a deglykozylace provádějí v mikrokapičkách za letu, což přináší výrazné zrychlení, optimalizaci spotřeby reagensů a vysokou reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl otestovat kombinované ošetření mAb v jediné ultrarychlé microdroplet reakci za použití AJS ESI zdroje. Hlavní body:

• Integrovat enzymatickou štěpící reakci (IdeS), redukci (DTT) a deglykozylaci (GlycINATOR®) v jednom průchodu.
• Optimalizovat parametry automatického injektoru na Agilent 1290 Infinity II LC.
• Vyhodnotit výtěžnost, reprodukovatelnost a kvalitu spekter pro různá protilátková činidla (NIST IgG1, Herceptin, Sigmamab).

Použitá instrumentace

• UHPLC systém Agilent 1290 Infinity II s automatickým injektorem v režimu FIA
• LC/Q-TOF Agilent 6545XT AdvanceBio spojený s AJS ESI v pozitivním režimu
• Software Agilent MassHunter Quantitative Analysis a BioConfirm v12 pro analýzu spekter

Použitá metodika

Vzorky mAb (0,5 mg/mL v 5 mM amonném uhličitanu) byly automaticky míchány s enzymy IdeS (1 U/µL) a GlycINATOR® (1 U/µL) nebo s DTT (10 mg/mL) v mikroobjemech 0,1–0,5 µL. Injekční program zahrnoval opakované tahy, míchání vzduchem, čekací kroky a spuštění vzdálené linie pro vytvoření microdroplet reakční zóny. Reakce probíhala během letu do hmotnostního analyzátoru. MS parametry: rozsah m/z 1350–10000, 2 spektra/s, sucho­cí a plášťové plyny 13 L/min a 12 L/min při 350 °C a 400 °C, kapilární napětí 4500–5000 V.

Hlavní výsledky a diskuse

• GlycINATOR® provedl rychlou a specifickou deglykozylaci Fc fragmentu na NIST IgG1, Herceptin i Sigmamab s vysokou věrností spektra.
• Kombinace IdeS a GlycINATOR® vedla ke vzniku definovaných subjednotek bez nutnosti separačních kroků.
• IdeS spolu s DTT účinně redukoval a štěpil protilátky na Fab a Fc fragmenty během jediné microdroplet reakce.
• Ve všech experimentech byla prokázána vysoká opakovatelnost a zachování integrity fragmentů.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zkrácení doby analýzy (řádově vteřiny).
• Snížení spotřeby enzymů a vzorku díky mikroobjemům.
• Možnost integrace do rutinních kontrol kvality a vývoje bioprocesů.
• Jednoduchá automatizace bez úprav zdroje ESI.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na další typy protilátek a proteinů s modifikacemi.
• Integrace dalších enzymatických i chemických reakcí v microdroplet formátu.
• Vylepšení softwarové automatizace a pokročilá interpretace spekter pomocí AI.
• Spolupráce s dalšími analytickými technikami pro komplexní charakterizaci biomolekul.

Závěr

Kombinované microdroplet reakce využívající automatický injektor a AJS ESI přinášejí rychlou, reprodukovatelnou a ekonomickou alternativu ke konvenčním postupům charakterizace mAb. Tento přístup má vysoký aplikační potenciál v biotechnologiích, farmaceutickém vývoji i laboratorní praxi QA/QC.

Reference

1. Lau J et al. Flash Characterization of Antibodies via Microdroplet Reactions in an Unmodified Jet Stream Source. Agilent Application Note 5994-6752EN, 2023
2. Genovis. GlycINATOR Endoglycosidase Information. https://www.genovis.com/smartenzymes/antibody-deglycosylation/glycinator/, 2024