FFPE RNA Quality Assessment with the Agilent Bioanalyzer and TapeStation Systems

Význam tématu

Formalin-fixace a parafinová embedace (FFPE) umožňují dlouhodobé uchování tkáňových vzorků s zachovanou morfologií, ale současně vedou k degradaci RNA a chemickým modifikacím, které ztěžují analýzu genové exprese. Pro úspěšnou přípravu knihoven pro sekvenování je nezbytná přesná kontrola kvality RNA. Metoda DV200, která kvantifikuje podíl fragmentů nad 200 nukleotidů, se ukazuje jako spolehlivý ukazatel hodnocení kvality FFPE RNA před dalším zpracováním.

Cíle a přehled studie

Cílem této technické studie bylo porovnat výkonnost přístrojů Agilent 2100 Bioanalyzer a Agilent 4200 TapeStation při hodnocení kvality RNA izolované z FFPE vzorků pomocí metriky DV200. Pro analýzu byly použity čtyři různé FFPE vzorky (hovězí játra, hovězí mozeček, myší játra a vepřové sleziny) v několika koncentracích.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky byly ředěny na koncentrace odpovídající rozsahu použitých souprav a analyzovány triplikátně. Na Bioanalyzeru byly aplikovány soupravy RNA 6000 Nano a RNA 6000 Pico, na TapeStationu zase RNA ScreenTape a High Sensitivity RNA ScreenTape. Data byla zpracována v softwaru RNA Expert s konfigurací pro DV200 a u TapeStationu ve „region mode“ pro interval 200–10 000 nt.

• Agilent 2100 Bioanalyzer s kit RNA 6000 Nano (p/n 5067-1511) a Pico (p/n 5067-1513)
• Agilent 4200 TapeStation s RNA ScreenTape (p/n 5067-5576) a High Sensitivity RNA ScreenTape (p/n 5067-5579)
• Agilent RNA Expert software a DV200 konfigurační soubor

Hlavní výsledky a diskuse

Elektroferogramy z obou systémů vykazovaly podobné průběhy v celém rozsahu velikostí fragmentů. Průměrné DV200 hodnoty se pohybovaly mezi 46 a 64 %, s rozdíly mezi systémy menšími než 6 %. Obě technologie dosáhly vnitřní přesnosti (%CV ≤ 5,7 %) u všech testovaných vzorků. Porovnání dvou kitů na Bioanalyzeru i dvou assay na TapeStationu ukázalo konzistentnost výsledků napříč koncentracemi.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé a přesné předběžné vyhodnocení FFPE RNA vhodné pro NGS, což šetří čas i materiál. Konkrétní DV200 skóre poskytuje jasná kritéria pro rozhodnutí o dalším zpracování vzorku a minimalizuje riziko neúspěšných knihoven.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další automatizace analýzy kvality RNA a integrace metody DV200 do plně robotizovaných NGS workflow. Vznikají i softwarové nástroje pro predikci výtěžku knihoven a zlepšenou interpretaci dat pomocí strojového učení. S rozvojem chemie a nových sond se mohou rozšířit aplikace na další typy degradované nukleové kyseliny.

Závěr

Bioanalyzer i TapeStation poskytují srovnatelné a vysoce reprodukovatelné DV200 hodnoty pro FFPE RNA. Uživatelé si tak mohou vybrat platformu dle dostupnosti a přitom zachovat konzistentní kontrolu kvality před sekvenováním.

Reference

• DV200 Evaluation with RNA ScreenTape Assays. Agilent Technologies, technický overview 5991-8355EN, 2017.
• Simplified DV200 Evaluation with the Agilent 2100 Bioanalyzer System. Agilent Technologies, technický overview 5991-8287EN, 2017.
• Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina, Technical Note 470-2014 001, 2016.