Best practices for liposome analysis with the charged aerosol detector

Význam tématu

Vývoj liposomálních formulací s lipidy HSPC, DSPE-PEG2000 a cholesterolem je klíčový v oblasti cílené léčby nádorů. Přesné stanovení poměru jednotlivých lipidů v konečném produktu zajišťuje kontrolu dávkování léčiva, stabilitu nanovesikul a reprodukovatelnost farmakologického účinku. Charged Aerosol Detector (CAD) nabízí univerzální detekci neabsorbujících látek, což usnadňuje rutinní kvalitativní a kvantitativní analýzu liposomálních vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo validovat robustní a snadno implementovatelnou chromatografickou metodu podle ASTM E3297-21 s CAD detektorem, omezit nároky na výběr kolony a systémové konfigurace a optimalizovat kalibrační postupy pro úsporu času analytika a zvýšení přesnosti výsledků.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnuje:

• Reverzní fází HPLC s krokovým gradientem mezi 40 % a 90 % organické fáze (acetonitril/voda a methanol, obě s 5 mM acetátem amonným) při 35 °C.
• Injekci vzorku 5 µL při průtoku 0,7 mL/min.
• Detekci CAD s teplotou odpařovacího členu 35 °C a nastavením Power Function Value (PFV) 1,0–1,2 pro optimalizaci lineární oblasti odezvy.

Použitá instrumentace:

• Thermo Scientific Vanquish Flex UHPLC s kvaternárním čerpadlem (LPG)
• Thermo Scientific Vanquish Core HPLC s kvaternárním (LPG) a binárním (HPG) čerpadlem
• Thermo Scientific Charged Aerosol Detector (Corona Veo CAD)
• Tři 150 × 3 mm C18 kolony (Hypersil GOLD, hybridní a siliková) s částicemi 3–3,5 µm
• Standardní laboratorní vybavení pro přípravu vzorků (sonikátor, vortex, mikrocetris, exsikace, amber lahvičky atd.)

Hlavní výsledky a diskuse

Ve čtyřech laboratořích na třech kontinentech a s dvanácti různými kombinacemi kolona–systém splnily všechny konfigurace kritéria metodiky:

• Rozlišení mezi všemi páry píku > 1,5
• Reprodukovatelnost plošných integrálů (RSD ≤ 3 %)
• Koeficient determinace kalibračních křivek R2 ≥ 0,995

Optimalizací PFV na 1,2 byla dosažena rozšířená lineární oblast (10–300 µg/g) a nižší LOQ pro všechny tři látky než při PFV 1,0. Krokový gradient umožnil společnou kvantifikaci DSPE-PEG2000 a HSPC jednou křivkou, čímž se zjednodušila analýza.

Přínosy a praktické využití metody

• Univerzální detekce CAD detektorem pro lipidy bez chromoforů
• Snížení počtu kalibrací díky uniformní odezvě a invertovanému gradientu
• Robustní přenositelnost mezi systémy Vanquish Flex a Core
• Vysoká citlivost a nízké LOQ vhodné pro QC liposomálních formulací

Budoucí trendy a možnosti využití

• Uplatnění CAD v analýze dalších nanoformulací a komplexních lipidových směsí
• Další rozvoj standardu ASTM včetně validace pro nové lipidové nosiče a excipienty
• Integrace CAD s hromadnou spektrometrií pro detailní charakterizaci nevolatilních látek
• Možnost vývoje rychlých gradientních programů pro vyšší průchodnost vzorků

Závěr

Navržená metoda HPLC-CAD dle ASTM E3297-21 byla úspěšně ověřena na více kontinentech a systémech. Jednotné kalibrační postupy a nastavení detektoru PFV 1,2 zajistily vysokou přesnost, citlivost a přenositelnost výsledků. Metoda nabízí jednoduchou implementaci v kontrolních laboratořích farmaceutického průmyslu.

Reference

1. ASTM E3297-21 Standard Test Method for Lipid Quantitation in Liposomal Formulations Using HPLC with CAD.
2. Thermo Fisher Scientific Technical Guide 73914: Getting the Most Out of Your Charged Aerosol Detector.
3. Thermo Fisher Scientific White Paper 72711: Instrument Parameter Guide for (U)HPLC Method Transfer.
4. Thermo Fisher Scientific Technical Note 73449: Why Use Charged Aerosol Detection with Inverse Gradient?
5. Eckardt M.; Kubicova M.; Simat T.J. Universal response quantification approach using a Corona Charged Aerosol Detector (CAD). J. Chromatogr. A. 2018, 1572, 187–202.
6. Thermo Fisher Scientific Application Note 001630: UHPLC/UV/CAD/MS for Extractables and Leachables.
7. Gamache P.H., ed. Charged Aerosol Detection for Liquid Chromatography; John Wiley & Sons 2017.
8. Thermo Fisher Scientific Technical Note 73299: CAD Calibration and Best Practices.
9. Thermo Fisher Scientific Technical Note 732998: CAD Power Function Optimization.