Molar Mass Determination of Collagen Peptides

Význam tématu

Kolagenní peptidy jsou klíčové složky potravinových doplňků a funkčních potravin díky své vysoké stravitelnosti a biologické dostupnosti. Jejich fyzikálně-chemické vlastnosti a funkce závisí na distribuci molárních hmotností (MMD). Spolehlivé stanovení distribuce molárních hmotností je proto kritické pro kontrolu kvality a konzistentní vlastnosti finálních produktů.

Cíle a přehled studie / článku

Studie si klade za cíl vyvinout ekonomickou a snadno implementovatelnou metodu GPC/SEC pro stanovení skutečných molárních hmotnostních rozdělení kolagenních peptidů v kvalitativní kontrole. Metoda by neměla vyžadovat specializované detektory a měla by být reprodukovatelná napříč laboratořemi. Klíčové kroky zahrnují identifikaci referenčních materiálů, nastavení kalibrace a ověření přístupu mezilaboratorním testem (round-robin).

Použitá metodika a instrumentace

Pro stanovení molárního rozdělení byla využita metoda gelové permeační chromatografie (GPC/SEC) s UV-Vis, viskometrickým a refrakčním index detektorem. Kalibrace probíhala ve dvou krocích:

• Univerzální kalibrace pomocí úzkých standardů pullulanu a dextranu a online viskometrie.
• Široká kalibrace („broad standard“) s využitím komerčně dostupných kolagenních peptidů a CNBr peptidů pro korekci základní kalibrace.

Použitá instrumentace

• Agilent GPC/SEC systém s isokratickým čerpadlem, degaserem, termostatovanou kolonnou a autosamplerem.
• Kolony Agilent PROTEEMA (100 Å, 8,0 mm × 300 mm) a precolumn (8,0 mm × 50 mm).
• Detektory: UV-Vis při 214 nm, viskometrický detektor, refrakční index detektor.
• Software Agilent WinGPC pro zpracování dat a asistované nastavení široké kalibrace.

Hlavní výsledky a diskuse

Byla vybudována univerzální kalibrační křivka, určena váhově střední molární hmotnost (Mw) a průměrná vnitřní viskozita pro pět referenčních kolagenních peptidů. Pomocí široké kalibrační procedury byla základní kalibrace (CNBr peptidy) převedena na kalibraci pro kolagenní peptidy, což významně upřesnilo molární hmotnosti. Meziluaboratorní test ve čtyřech laboratořích na šesti vzorcích prokázal odchylku výsledků mezi laboratořemi pod 4 % a průměrná odchylka od skutečných hodnot pod 9 %.

Přínosy a praktické využití metody

• Zavedená metoda nevyžaduje pokročilé detektory jako MALS či online visko-metrii.
• Ekonomická a snadno implementovatelná v běžných QC laboratořích.
• Reprodukovatelné výsledky s možností mezilaboratorního srovnání.
• Blízkost ke skutečným molárním hmotnostem kolagenních peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření postupu na další hydrolyzované proteiny a funkční makromolekuly.
• Integrace do plně automatizovaných výrobních a QC linek.
• Využití strojového učení pro optimalizaci kalibračních parametrů.
• Kombinace metody s jinými detekčními principy pro ještě vyšší přesnost.

Závěr

Navržená GPC/SEC metoda s širokou kalibrací na bázi kolagenních peptidů umožňuje přesné, robustní a nákladově efektivní stanovení molárních rozdělení kolagenních peptidů v QC aplikacích. Prokázaná mezilaboratorní shoda a blízkost získaných hodnot skutečným molárním hmotnostem potvrzují praktičnost postupu.

Reference

1. Striegel A. M. et al. Modern Size Exclusion Liquid Chromatography; 2nd ed.; John Wiley & Sons, 2009.
2. Grubišić Ž., Rempp P., Benoit H. A Universal Calibration for Gel Permeation Chromatography. Materials Sci. J. Polymer Sci. Part B, 1967, B5, 753–1067.
3. Agilent Technologies. GPC/SEC Theory and Background, eBook 5994-5935EN, 2018.
4. Kratochvíl P. Classical Light Scattering from Polymer Solutions. Elsevier, 1987.
5. Agilent Technologies. GPC/SEC Detection, eBook 5994-5937EN, 2019.
6. Held D. GPC/SEC-Light Scattering: Garbage In, Garbage Out. The Column, 2016.
7. Kilz P., Gores F. Accuracy and Precision in GPC/SEC. The Column, 2008.
8. Data Integrity in GPC/SEC. LC/GC Europe, 2020.
9. GME Collagen Peptides Monograph, Version 1, October 2020.