Ultra-high sensitive Single Cell Proteomics on the timsTOF Ultra

Význam tématu

Single-cell proteomika umožňuje detailní analýzu proteinového složení jednotlivých buněk, což je klíčové pro pochopení buněčné heterogenity v biologických a klinických vzorcích. Ultra-vysoká citlivost hmotnostní spektrometrie otevírá cestu k monitorování proteomů na úrovni jednotlivých buněk.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a vyhodnotit plně automatizovaný workflow pro single-cell proteomiku s maximální citlivostí a reprodukovatelností. Studie porovnává různé formáty vzorků (proteoCHIP vs. mikrotitrační destička), délky aktivních gradientů (10 a 22 minut) a analyzuje identifikaci proteinů u jednotlivých i skupin buněk (1–20 buněk HeLa, K562 diluce, různé subpopulace PBMC).

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky:

• Automatizované osazení jednotlivých buněk platformou cellenONE® do proteoCHIP LF 48.
• Sušení ve formátu proteoCHIP a následné resuspendování funkcí dissolve v nanoElute 2 CTC autosampleru.

Chromatografie a hmotová spektrometrie:

• LC na Aurora Rapid 75 μm × 5 cm kolonce (IonOpticks).
• timsTOF Ultra pracující v dia-PASEF režimu s aktivním gradientem 10 minut (80 SPD) nebo 22 minut (32 SPD).

Data-processing:

• Spectronaut 18 s algoritmem directDIA+ v režimu bez metody vyhodnocení i s metodou vyhodnocení vztaženou k referenčním běhům (8 ng K562).

Hlavní výsledky a diskuse

1) K562 peptide dilution series:

• Detekce proteinových skupin až při 15,6 pg vstupního materiálu.
• Stabilní identifikační a kvantitativní výkony (CV <20 % i <10 %) až do nízkých nánogramových koncentrací.

2) Single-cell HeLa:

• Identifikováno přes 1 700 proteinových skupin na jednu buňku.
• Reprodukovatelné výsledky mezi jednotlivými buňkami (nízká variabilita identifikací).

3) Analýza PBMC subpopulací (CD4+, CD8+, CD14+, CD19+):

• PCA a heatmap ukazují jasné rozlišení buněčných typů podle proteomového profilu.
• Více než 4 000 proteinových skupin lze identifikovat u jednotlivých buněk s rozdílnými abundancemi specifickými pro subpopulaci.

Přínosy a praktické využití metody

Workflow nabízí hands-free a pipetovací-free přípravu vzorku s minimálními ztrátami, vysokou citlivostí a rychlostí analýzy. Metoda je vhodná pro studií buněčné heterogenity, biomarker discovery a průmyslové aplikace v QA/QC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další miniaturizace a integrace přípravy vzorku přímo na mikrofluidních platformách.
• Spojování s prostorovou proteomikou (spatial proteomics) pro lokalizaci proteomů in situ.
• Nasazení v klinických studiích pro analýzu vzácných buněčných subpopulací a minimalizaci vzorkové hmoty.
• Využití vylepšených knihoven spekter a strojového učení pro hlubší identifikaci a kvantifikaci.

Závěr

Představený plně automatizovaný workflow na platformě timsTOF Ultra dosahuje ultra-vysoké citlivosti pro single-cell proteomiku s vysokou reprodukovatelností i při extrémně nízkých hmotnostech vzorku. Metoda otevírá nové možnosti pro detailní studium buněčné heterogenity a aplikace v biomedicínském výzkumu.

Reference

© 2024 Bruker – For Research Use Only. Not For Clinical Procedures.