Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) for Simultaneous and Fast Analysis of Melamine, Cyanuric Acid, and other Metabolites in Milk and Protein- Rich Powders

Hydrophilic Interaction Chromatography (HILIC) pro simultánní a rychlou analýzu melaminu, kyseliny cyanurové a dalších metabolitů v mléce a práškových bílkovinách

Význam tématu

Polarita melaminu, kyseliny cyanurové a jejich metabolitů představuje výzvu pro běžné chromatografické techniky. HILIC poskytuje účinné a rychlé řešení pro separaci vysoce polárních sloučenin, které se obtížně analyzují v prostředí reverzní fáze či iontové výměny. Vzhledem k potenciálnímu ohrožení veřejného zdraví při kontaminaci mléčných výrobků melaminem uplatňují regulační orgány (např. FDA) přísné metody sledování těchto látek.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo modifikovat a rozšířit existující metodiku FDA pro detekci melaminu a kyseliny cyanurové tak, aby bylo možné současně stanovit i další metabolity (ammeline, ammelide). Práce demonstruje novou HILIC metodu využívající aminově vázanou fázi pro rychlou separaci čtyř analyzovaných sloučenin s potvrzením pomocí LC-MS/MS během jediné 7minutové analýzy.

Použitá metodika

Postup přípravy vzorku vychází z FDA metody s přidáním čistícího stupně pomocí SPE Bond Elut Plexa. Po nakyselení vzorku formiovou kyselinou, extrakci, centrifugaci a ředění acetonitrilem následuje filtrace na cartridge SPE, která zachytí matricové interferenty a propustí polární analyty.
Chromatografické podmínky:

• Kolona Polaris NH2, 5 µm, 150 × 3 mm
• Mobilní fáze A: acetonitril, B: 10 mM acetát amonný s 0,1 % kyseliny octové
• Izo­kratický režim: 78 % A/22 % B, průtok 0,4 mL/min, teplota 40 °C
• Objem vstřiku: 20 µL

Použitá instrumentace

• Varian 320-MS triple kvadrupól s ESI v pozitivním/negativním módu
• Varian 212-LC binární gradientní pumpy
• Combi PAL autosampler
• SPE cartridge Bond Elut Plexa 60 mg/3 mL

Hlavní výsledky a diskuse

• Čas separace všech čtyř sloučenin byl ≤ 7 min s baseline separací.
• Kalibrační křivky v rozsahu 0,25–5 µg/g vykazovaly r² > 0,99.
• Signál-šum na nejnižší úrovni (0,25 µg/g) dosahoval > 16:1, což je nad požadavkem FDA.
• Recovery melaminu a kyseliny cyanurové: 84–95 %; ammeline a ammelide: 68–89 %; RSD < 20 %.
• Robustnost kolony Polaris NH2 prokázána při > 1500 injekcích bez výrazné ztráty rozlišení.
• SPE čistící krok efektivně odstranil mnohé matricové rušitele, jak bylo patrné z porovnání chromatogramů před a po úpravě.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí spolehlivé simultánní stanovení čtyř polárních sloučenin v komplexních potravinářských matricích během krátké analýzy. Tím se výrazně zvyšuje laboratorní kapacita a snižuje čas pro rozhodnutí při monitoringu bezpečnosti potravin.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření HILIC metodiky na další polární pesticidy, farmaka či potravinářské příměsi.
• Vývoj nových stacionárních fází s optimalizovanou selektivitou a dlouhodobou stabilitou.
• Automatizace přípravy vzorků a nasazení vysokopropustných LC-MS/MS platforem pro rutinní kontrolu.
• Green chemistry přístup se snížením objemu a koncentrace organických rozpouštědel.

Závěr

Popsaná HILIC-LC-MS/MS metoda na bázi aminově vázané fáze Polaris NH2 spolu se SPE čistícím modulem Bond Elut Plexa umožňuje rychlou, robustní a citlivou analýzu melaminu, kyseliny cyanurové, ammeline a ammelide v mléčných produktech a práškových vzorcích. Splňuje požadavky FDA na linearitu, citlivost a opakovatelnost a je vhodná pro rutinní monitoring kvality a bezpečnosti potravinářských surovin.

Reference

• Determination of Melamine and Cyanuric Acid Residues in Infant Formula using LC-MS/MS, Sherri Turnipseed et al., FDA LIB No. 4421, Vol. 24, 2008.
• Effect of Stationary Phase Chemistry on Selectivity of Pharmaceuticals, Pesticides, and Oligosaccharides in HILIC Separations, R. Arora et al., Pittcon 2009.
• Simultaneous and Fast Analysis of Melamine, Cyanuric Acid, and Related Compounds in Milk and Infant Formula by LC/MS/MS, E. Chang, R. Arora, Varian AN SI-01916.