Separation Improvements with 2D LC

Význam tématu

Separační kapacita a rozlišení složitých vzorků jsou klíčové pro analýzu farmaceutických a environmentálních směsí. Dvoudimenzionální kapalinová chromatografie (2D-LC) nabízí zvýšenou citlivost a selektivitu díky kombinaci ortogonálních fází, což umožňuje oddělit koelutující komponenty, především raně elujících polárních sloučenin.

Cíle a přehled studie / článku

Hlavním cílem bylo porovnat výkonnost různých superporózních filmačních kolon ve formátech C18, cyano, fenyl-hexyl a SB-AQ v režimech heart-cutting (LC-LC) a comprehensive LC×LC. Modelovými sloučeninami byla směs sulfa léků, záměrně obsahující koelutující páry, aby se demonstrovala důležitost volby druhé dimensionální fáze.

Použitá instrumentace

Agilent 1290 Infinity 2D-LC sestava:

• Agilent G1329A 1200 autosampler
• Agilent G1311A 1200 Quaternary Pump (400 bar)
• Agilent G4220A Infinity Diode Array Detector (2. D1 detektor)
• Agilent G1315C 1200 Diode Array Detector (1. D1 detektor)
• Agilent G4212A Infinity DAD (2. D2 detektor)
• Agilent G1316C Infinity Thermostatted Column Compartment
• 2-position/4-port duo ventil (G4236A) pro srdcové řezy i comprehensive LC×LC
• Software OpenLab C 1.04 s modulem pro řízení 2D-LC

Metodika

První dimenze probíhala na koloně Poroshell 120 EC-C18 (2,1×100 mm, 2,7 μm) s gradientem formamidové kyseliny. Vybrané píky byly vzorkovány technikou protisměrného plnění kapiláry do smyček a přepínacím ventilem vedeny do druhé dimenze. Druhá dimenze využívala různé fáze (SB-C18, EC-CN, Phenyl-Hexyl, SB-AQ, Bonus RP) s odpovídajícím gradientem a dobou běhu sladěnou s plněním z první dimenze.

Hlavní výsledky a diskuse

Heart-cutting experimenty ukázaly, že volba disimilární fáze ve druhé dimenzi zásadně ovlivňuje schopnost rozdělit koelutující píky:

• Bonus RP prokázala výjimečnou ortogonalitu (F-hodnota 255 vůči C18) a nejvyšší diferenciaci raně elujících látek.
• Phenyl-Hexyl fáze umožnila separaci díky π-π interakcím, byť byla částečně ovlivněna alifatickými vlastnostmi.
• CN a SB-AQ ukázaly zlepšené rozlišení polárních analyzovaných sloučenin ve srovnání s klasickým C18.

Comprehensive LC×LC experimenty demonstrovaly až 3–4násobné zvýšení kapacity separace a věrnou rekonstrukci chromatogramů z první a druhé dimenze.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda usnadňuje rutinní kontrolu nečistot ve farmaceutickém vývoji a QA/QC, zejména u raně elujících polárních sloučenin. Nový 2pos/4port-duo ventil zajišťuje symetrické plnění a vyprazdňování smyček bez nutnosti složité synchronizace, čímž se snižuje šíření pásma a zjednodušuje provoz.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření výběru mobilních fází o methanol a různé pufry.
• Aplikace HILIC kolon pro extrémně polární analyty.
• Využití databází (PQRI) pro optimalizaci ortogonality fází.
• Další automatizace a pokročilá datová vizualizace pro rychlejší interpretaci 2D chromatogramů.

Závěr

Správný výběr disimilární druhé dimenze a využití superporózních kolon významně zvyšuje výkon 2D-LC. Bonus RP a Phenyl-Hexyl fáze patří mezi nejperspektivnější pro rozlišení raně elujících a koelutujících látek, přičemž nový ventil značně zjednodušuje obsluhu.

Reference

• Long W.J., Brooks A.E., Joseph M. Separation Improvements with 2D LC. Poster 550-3P, Pittcon 2013, Philadelphia, PA.
• Agilent Technologies. Agilent publication number 5990-5572EN.