Automated bacterial sample preparation from agar to MALDI target for routine bacterial identification

Význam tématu

Ručně prováděná příprava bakteriálních vzorků pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii je časově náročná, pracná a s nízkou reprodukovatelností mezi operátory. Zefektivnění tohoto kroku robotickou automatizací může významně zvýšit konzistenci přípravy vzorků, minimalizovat operátorskou chybu a zkrátit dobu analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyhodnotit využití PIXL koloniového pickovacího robota pro přípravu bakteriálních vzorků z agarových destiček přímo na MALDI-TOF destičku. Autoři porovnali tři různé způsoby nanášení bakterií a matrice a vybrali nejvhodnější postup s ohledem na identifikační přesnost, počet detekovaných signálů a jednoduchost implementace do rutinní praxe.

Použitá metodika

Vzorky Escherichia coli sloužily k vývoji metodického postupu, dále byla ověřena metoda na Bacillus subtilis, Cellulomonas uda a Pantoea agglomerans. Bakterie se kultivovaly na Columbia agaru s 5 % krve koně, po pasážích uchovávány zmražené na mikrobankových kuličkách. Pro nanášení se testovaly tři způsoby:

• Metoda A – smíchání bakterií v MTP jamce s matrikovým roztokem (50 µl) a jednorázové vsáknutí na MALDI destičku
• Metoda B – přímé nanášení bakterií robotem podobně třecí technice, následné manuální přidání matrice (jedno/dvojí pokrytí)
• Metoda C – kombinace přímého nanášení bakterií a automatického dvoufázového nanášení matrice pomocí robota

Použitá instrumentace

Pro přípravu vzorků byl použit koloniový picker PIXL od Singer Instruments. Analýza probíhala na iDplus Performance MALDI-TOF přístroji značky Shimadzu. Vzorky se ukládaly na jednorázové FlexiMass-DS sklíčka a jako matrici použit 3-lodný 4-hydroxycinnamát (CHCA) ve směsi acetonitril/ethanol/voda s 3 % TFA.

Hlavní výsledky a diskuse

Nejlepší výsledky přinesla metoda C, která zajišťovala více než 99,9% jistotu identifikace E. coli i ostatních testovaných bakterií. Dvojí nanesení matrice vedlo k průměrnému počtu detekovaných signálů kolem 214 oproti 172 u jednorázového pokrytí. U metody A se objevila kontaminace plastizéry z MTP destičky, což vedlo k nemožnosti identifikace.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované nanášení zlepšuje konzistenci přípravy vzorků, snižuje závislost na zkušenostech operátora a zrychluje rutinní provoz laboratoří. Metoda je vhodná pro vysokopropustné skríninky a rutinní QA/QC analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje plnou integraci robotu s online databázemi výsledků, optimalizaci nanášení menších objemů matrice, minimalizaci kontaminace a rozšíření aplikačního spektra na klinické diagnostické postupy.

Závěr

Vyhodnocení ukázalo, že koloniový picker PIXL lze úspěšně adaptovat pro přípravu vzorků pro MALDI-TOF hmotnostní spektrometrii. Nejlepší výkon vykázala metoda kombinující robotické nanesení bakterií a automatizované dvojí nanesení matrice, která dosahuje citlivosti a spolehlivosti srovnatelné s manuální přípravou.

Reference

Michael D. Nairn, Philip Kirk, Matthew E. Openshaw, Oliver Severn, Leah Ashley. Automated bacterial sample preparation from agar to MALDI target for routine bacterial identification. Shimadzu, Singer Instruments.