Amino Acid Profiling of Fish Feeds Using Agilent 1260 Infinity II LC with DAD and FLD

Význam tématu

Analýza aminokyselinového profilu krmiv pro hospodářské ryby je klíčová pro optimalizaci výživy, zdravotního stavu a růstu ryb ve fiskálním průmyslu. Cílená kvantifikace jednotlivých aminokyselin, včetně taurinu, theaninu, kyseliny glukosaminové a cysteinu, umožňuje přesné stanovení kvality krmné směsi a optimalizaci receptur.

Cíle a přehled studie

Studie si klade za cíl rozšířit existující chromatografickou metodu Agilent pro analýzu 20 základních aminokyselin na celkem 24 cílových sloučenin. Metoda je optimalizována pro simultánní stanovení taurinu, theaninu, glukosaminu a cysteinu spolu s ostatními aminokyselinami v komplexních rybích krmivech. Porovnány byly dva vzorky krmiva po kyselé hydrolýze.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf Agilent 1260 Infinity II LC
• Diodový array detektor (DAD) Agilent 1260 Infinity II
• Fluorescenční detektor (FLD) Agilent 1260 Infinity II
• Multisampler s automatizovanou prekolonální derivatizací
• Kolona AdvanceBio AAA 3,0×100 mm, 2,7 µm se strážnou kolonou 3,0×5 mm, 2,7 µm
• Filtrovací zařízení Agilent Captiva premium (0,2 µm)

Použitá metodika

Vzorky rybího krmiva byly homogenizovány a hydrolizovány v 6 N HCl při 110 °C po dobu 24 hodin. Po odstředění a filtraci byl extrakt ředěn 100× a doplněn interními standardy norvalin a sarkosin. Prekolonální derivatizace probíhala sekvenčním mísením zásadného borátového pufru, OPA a FMOC činidel v autosampleru. Chromatografie byla prováděna gradientem mobilních fází A (10 mM Na₂HPO₄/10 mM Na₂B₄O₇, pH 8,2) a B (acetonitril/methanol/voda 45/45/10), průtok 0,6 mL/min, teplota kolony 40 °C. Detekce primárně fluorescenční (exc. 345 nm, em. 455 nm) s doplňkovou UV detekcí (338 nm) pro cystein a cystin.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla nízkých LOD 0,45 pmol/µL (0,90 pmol/µL LOQ) pro většinu aminokyselin, cystein byl kvantifikován od 4,5 pmol/µL (9,0 pmol/µL LOQ). Koeficient determinace R² ≥ 0,999 a retence RSD < 0,4 %, plocha RSD < 1 % (n=3). Rozlišení mezi špičkami většinou nad 1,5. Ve vzorcích krmiva byla potvrzena přítomnost 22 aminokyselin, cystein a cystin detekovány pouze DAD. Recoverie po post-spiku dosahovaly 70–130 %. Čas analýzy 24 min plus 2 min reequilibrace.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje přesnou a citlivou kvantifikaci rozšířeného spektra aminokyselin v různých typech rybích krmiv. Výhody spočívají v plně automatizované prekolonální derivatizaci, snížení lidských chyb, efektivním čištění vzorku a kombinované detekci UV/FLD pro širší detekční rozsah. Uplatnění nalezne v kontrolních laboratořích, vývojových odděleních krmivářského průmyslu i v nutričním výzkumu akvakultury.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody o další biologicky významné deriváty, přechod na vysokorychlostní UHPLC nebo spojení s hmotnostní spektrometrií pro zlepšení selektivity a citlivosti. Dalšími kroky jsou validace pro rozličné druhy krmiv, robustní inter-laboratorní studia a využití stabilně izotopovaných standardů pro absolutní kvantifikaci.

Závěr

Navržená analytická metoda na bázi Agilent 1260 Infinity II LC/DAD/FLD kombinuje rychlou a plně automatizovanou derivatizaci s vysoce citlivou detekcí a robustní chromatografií. Je vhodná pro komplexní aminokyselinové profilování rybích krmiv a poskytuje spolehlivé údaje potřebné pro optimalizaci výživy a kvality krmných směsí.

Reference

• 1. Deng J., Zhang X., Bi B., Kong L., Kang B. Dietary Protein Requirement of Juvenile Asian Red-Tailed Catfish Hemibagrus wyckioides. Animal Feed Science and Technology, 2011;170(3):231–238.
• 2. Sampath W.W.H.A., Rathnayake R.M.D.S., Yang M., Zhang W., Mai K. Roles of Dietary Taurine in Fish Nutrition. Marine Life Science & Technology, 2020;2(4):360–375.
• 3. Liu J.X., Zhu K.C., Guo H.Y., Liu B.S., Zhang N., Zhang D.C. Effects of Cysteine Addition to Low-Fishmeal Diets on Growth, Anti-Oxidative Stress, Intestine Immunity, and Streptococcus Agalactiae Resistance in Juvenile Golden Pompano (Trachinotus ovatus). Frontiers in Immunology, 2022;13:1066936.
• 4. Alagawany M. et al. Nutritional Applications and Beneficial Health Applications of Green Tea and L-Theanine In Some Animal Species: A Review. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition, 2020;104(1):245–256.
• 5. Chowdhary S. et al. Partial Replacement of Dietary Animal Protein with Vegetable Protein Blend With Different Proportions of Glucosamine on Growth, Feed Efficiency, Body Composition and Survival of Fingerlings of Asian Catfish (Clarias batrachus). National Academy Science Letters, 2012;35:291–297.
• 6. Dai Z., Wu Z., Jia S., Wu G. Analysis of Amino Acid Composition in Proteins of Animal Tissues and Foods as Pre-Column O-Phthaldialdehyde Derivatives by HPLC with Fluorescence Detection. Journal of Chromatography B, 2014;964:116–127.
• 7. Lee K.S., Drescher D.G. Derivatization of Cysteine and Cystine for Fluorescence Amino Acid Analysis with the O-Phthaldialdehyde/2-Mercaptoethanol Reagent. Journal of Biological Chemistry, 1979;254(14):6248–6251.