EPITACHOFORÉZA – METODA PRO ZÍSKÁVÁNÍ BIOMAKROMOLEKUL Z KOMPLEXNÍCH MATRIC

Význam tématu

Biologické tekutiny obsahují biomakromolekuly jako DNA a proteiny v nízkých koncentracích a v náročných matricích, což ztěžuje jejich analýzu. Epitachoforéza nabízí kombinaci výrazného koncentrace a čištění vzorků, čímž podporuje citlivou detekci biomarkerů pro diagnostiku i výzkum.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ukázat možnosti použití preparativní metody epitachoforézy (ETP) k získání a koncentraci proteinů a DNA z komplexních biologických matric. Autoři představili optimalizaci elektrolytových systémů, gelů a experimentálních podmínek, a demonstrovali využití ETP pro vzorky moči a kultivačního média.

Použitá metodika a instrumentace

Epitachoforéza probíhá v dvou soustředných kruhových nádobách spojených dialyzační membránou ve sběrné jamce. Ve svrchní nádobě je biologická vzorková matrice v terminating electrolyte, ve spodní vedoucí elektrolyt. Elektrody vytvářejí diskontinuální elektrolytické rozhraní, kde analyty migrují a koncentrují se ve sběrné jamce.

• Zařízení ETP s elektrodami a dialyzační membránou
• Separativní gel: agarózový nebo polyakrylamidový (0,5 % agaróza, 6 % 37,5:1 polyakrylamid)
• Elektrolyty: LE – 40 mM octan amonný pH 4, TE – 20 mM octová kyselina
• Zdroje vysokého napětí s regulací výkonu (5 W a následné snížení na 1 W)
• Sběrná jamka s dialyzační membránou (cut-off pro oddělení makromolekul)

Hlavní výsledky a diskuse

• Koncentrační faktory pro cytochrom c dosahovaly 29–67, s výtěžností až 98 % ve standardních roztocích.
• V biologických vzorcích (moč) se podařilo zvýšit koncentraci cytochromu c 32násobně.
• Optimalizace výkonu zabránila přehřívání a denaturaci proteinů během 45 minut experimentu.
• Volba gelu ovlivnila absorpci: agaróza vhodná pro cytochrom c, polyakrylamid pro myoglobin/hemoglobin.
• Umožněno přečištění od solí a malých molekul díky dialýze v sběrné jamce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlé (pod 1 h) jednokrokové čištění a zesílení analyzovaných biomolekul bez potřeby surfaktantů či vícekrokových extrakcí. Výsledná frakce je ve slabě pufrovaném roztoku kompatibilním s hmotnostní spektrometrií, kapilární či gelovou elektroforézou, ELISA či sekvenováním.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace ETP s online detekčními technikami včetně hmotnostní spektrometrie a kapilární elektroforézy.
• Vývoj miniaturizované a automatizované ETP pro mikrofluidní platformy.
• Aplikace na další typy biomakromolekul a komplexních vzorcích, např. sérum, buňky, potravinářské matrice.
• Možnosti paralelních či vysokopropustných úprav vzorků v klinické a průmyslové praxi.

Závěr

Epitachoforéza představuje perspektivní preparativní techniku pro efektivní koncentraci a čištění proteinů a DNA z náročných matric. Díky vysoké výtěžnosti, jednoduchosti a kompatibilitě se širokou škálou analytických nástrojů může výrazně zrychlit a zlepšit biomarkerovou analýzu.

Reference

1. Wishart D. S. et al. Nucleic Acids Res. 49, D1 (2021)
2. Aronson J. K., Ferner R. E. Curr. Protoc. Pharmacol. 76, 1 (2017)
3. Thway T., Salimi-Moosavi H. Bioanalysis 6, 8 (2014)
4. Foret F. et al. Anal. Chem. 91, 11 (2019)
5. Voráčová I. et al. Anal. Chim. Acta 1154, 338246 (2021)
6. Datinská V. et al. Sci. Rep. 11, 1 (2021)
7. Hrušková H. et al. J. Chromatogr. A 1685, 463591 (2022)