NISTmAb characterization with a high-performance RP chromatography column

Význam tématu

Monoklonální protilátky představují klíčovou třídu biologických léčiv s vysokou poptávkou po přesné a robustní analýze. Reverzně-fázová chromatografie (RP) umožňuje detailní rozlišení variant proteinů včetně posttranslačních modifikací, což je nezbytné pro vývoj a kontrolu kvality terapeutických mAb.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit robustnost, reprodukovatelnost, míru carry-over, návratnost, přesnost a preciznost kvantifikace referenčního mAb NISTmAb (IgG1K) na platformě Vanquish Horizon UHPLC ve spojení s polymerovou MAbPac RP kolonkou. Výsledky byly srovnány se standardní 300 Å C4 silikátovou kolonou.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie byla prováděna v režimu RP za použití gradientu vody/TFA a acetonitrilu/TFA při 80 °C. Porovnávací kolony:

• polymerová MAbPac RP 2.1 × 50 mm, 4 µm, 1500 Å
• C4 silikátová Biobasic C4 2.1 × 50 mm, 5 µm, 300 Å

Systém Vanquish Horizon UHPLC zahrnoval systémovou základnu, dvojitý pumpní modul, termostatickou komoru, autosampler se smyčkou 25 µL, DAD detektor 280 nm a Chromeleon CDS 7.2 SR5 pro zpracování dat.

Hlavní výsledky a diskuse

• Při srovnání s C4 kolonou vykazovala MAbPac RP užší šířku vrcholu (2.2 s vs. 4.4 s), symetričtější tvar (0.95 vs. 1.38) a detekci až osmi variant lysinových forem oproti jediné špičce u silikátu.
• Odolnost kolony byla potvrzena více než 1100 po sobě jdoucími injekcemi bez významného zhoršení retence (0.12 % RSD), šířky vrcholu (2.17 % RSD) či asymetrie (0.96 % RSD).
• Lot-to-lot variabilita pro retenční časy zůstala nízká (0.33 % RSD pro NISTmAb a 0.30 % pro lysinovou variantu).
• Kalibrační křivka v rozsahu 0.1–20 µg vykázala vynikající linearitu (R2 > 0.9994) a QC úrovně (0.15, 0.7, 7 µg) dosáhly přesnosti 93–104 % s RSD < 3.1 %.
• Návratnost proteinu dosáhla 96.4 % na polymerové koloně oproti 87 % na silikátové.
• Carry-over kolony zůstalo pod 0.3 % v celém testovaném rozsahu 0.02–20 µg.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma Vanquish UHPLC s MAbPac RP kolonou poskytuje vysoce reprodukovatelné, robustní a citlivé RP analýzy monoklonálních protilátek. Nízký carry-over a vysoká návratnost zajišťují spolehlivou kvantifikaci při vývoji a kontrole kvality biologik.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s víceatributovými metodami (MRM, HRMS) pro detailní mapování modifikací.
• Automatizace přípravy vzorků a datového zpracování pro vyšší laboratorní produktivitu.
• Vývoj nových polymerových materiálů pro ještě lepší separační výkon a vyšší životnost.
• Adaptace metodiky na online coupling s hmotnostní spektrometrií pro rychlé charakterizace strukturálních variant.

Závěr

Polymerová MAbPac RP kolona ve spojení s Vanquish Horizon UHPLC prokázala vynikající výkon při rozlišení, reprodukovatelnosti, životnosti a kvantifikaci NISTmAb. Nízké carry-over, vysoká návratnost a široký lineární rozsah činí tuto kombinaci ideální pro rutinní i pokročilé analytické úlohy v oblasti monoklonálních protilátek.

Reference

1. High Performance RP Chromatography Column for mAb Analysis, Thermo Fisher Scientific Application Note PS21199-EN.
2. Using the NISTmAb reference standard to demonstrate a simple approach to charge variant analysis, Thermo Fisher Scientific AN21684-EN, 2017.
3. Tarlov MJ, Choquette SJ. Reference Material 8671. NIST Report of Investigation, October 2016.
4. Chromatography Today, “Why do I have carryover?”, Aug/Sep 2013.
5. Hewitson HB et al. Quantification of monoclonal antibodies with reversed phase chromatography using BEH C4 chemistry, Waters Application Note 720003944EN, 2011.